De Posse De Uma Quantidade Suficiente De DNA De Uma Determinada Espécie, Relate, Com Riqueza De Detalhes, Os Passos A Serem Feitos Para Obtenção (prospecção) De Regiões Conhecidas Como Microssatélites Ou SSR - Regiões Estas Que Serão Utili

Criar seres novos têm sido, por bilhões de anos, o privilégio da Natureza,

através do processo contínuo de mutação e seleção natural e por outros

mecanismos de alteração do DNA que agora começam a ser compreendidos. Mas a

humanidade sempre "criou" seus próprios seres, geralmente extraordinários.

Entretanto, a criação de híbridos de verdade é muito mais difícil do que

insinua o cinema ou pensam as pessoas, porque a maior parte das espécies têm

algum tipo de restrição para o cruzamento com uma espécie diversa. Na melhor das

hipóteses o híbrido costuma ser estéril. Esta é a regra entre animais. Os híbridos

entre vertebrados, por exemplo, são raros, e quando ocorrem, em geral são estéreis.

É o caso da mula e do burro, híbridos de cavalos e jumentos. Entre plantas, contudo,

a obtenção de híbridos é muito mais fácil e uma enorme fração das plantas que hoje

cultivamos é produto de cruzamento entre duas ou mais espécies.

Uma abordagem mais simples, em teoria, é a clonagem de genes de um

organismo e a transfecção destes para outro organismo. A vantagem desta

abordagem é que se pode selecionar da espécie doadora apenas as marcas que

interessam, evitando a introdução de genes indesejados. Adicionalmente, ela

permite total controle sobre a construção final, contornando as recombinações que a

Natureza produz durante a reprodução sexuada (entre indivíduos da mesma espécie

ou não). Clonar genes parece simples a princípio, mas as ferramentas para cortar

DNA e "emendar" os fragmentos com um vetor (DNA que se replica e que desta

forma conserva o pedaço "emendado" nele, chamado inserto) não eram conhecidas

até o meio da década de 70.

Em síntese, clonagem é multiplicar assexuadamente. Na Biologia Molecular,

significa mais especificamente crescer uma colônia de bactérias a partir de uma

célula única. Já Clonagem de genes é essencialmente o processo de amplificar

seletivamente um gene particular, incorporando- o numa bactéria e clonando a

bactéria.

Por que clonar?

•Sequenciamento de DNA

•Separar fragmentos de DNA em clones independentes

•Estudar a transcrição e a tradução do gene

•Fazer estudos de expressão funcional

•Sintetizar proteínas para produção de anticorpos

•Sintetizar proteínas para uso terapêutico

Para exemplificar o procedimento empregaremos um plasmídeo como vetor

de clonagem e cortaremos o plasmídeo e o DNA a ser clonado com uma enzima de

restrição que forma extremidades coesivas. É preciso ter em mente contudo, que

existem vários outros vetores de clonagem e diferentes formas de fragmentar e

clonar o DNA (com enzimas de restrição que deixam extremidades cegas, com ou

sem posterior encaudeamento, com nebulização, com prensa francesa, etc.).  

         Um vetor de clonagem deve ter certas características, que estão sumarizadas

na figura abaixo.

Figura 1.1.a. - Características essenciais e adicionais (desejáveis) de um vetor de clonagem. Apesar

da maior parte dos vetores serem compostos de fitas duplas de DNA, há exceções, como o fago

filamentoso, com DNA fita simples.

            O processo se inicia pela extração do DNA das células doadoras e do

plasmídeo (neste exemplo, um plasmídeo pequeno, de aprox. 4,5 kpb, da bactéria E.

coli). A extração de DNA não é um processo complexo: resumidamente, as células

são lisadas com um detergente, os restos celulares e boa parte das proteínas

precipitadas por centrifugação em presença de uma concentração elevada de sal

(em geral acetato de potássio) e o sobrenadante, transferido para outro tubo, é

misturado com isopropanol. O DNA não é solúvel neste álcool, mesmo diluído com

água, e tende a precipitar. Para acelerar o processo centrifuga-se o material a

13.000 rpm por alguns minutos e o precipitado é ressuspenso em água ou num

tampão adequado. O DNA que se obtém desta forma não é muito limpo, mas serve

para uma boa parte das aplicações corriqueiras de laboratório. Atualmente kits

comerciais permitem a extração rápida de DNA de praticamente qualquer tipo de

célula, em quantidades e grau de pureza que satisfaçam ao mais exigente

pesquisador.

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