Microbiologia

INTRODUÇÃO

A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram. Ela é um dos procedimentos de coloração mais úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram negativas. A coloração de Gram foi originalmente descrita por Christian Gram em 1884 e modificada por Hucker em 1921, comumente usada na prática bacteriológica devido proporcionar uma melhor estabilidade dos reagentes e melhor diferenciação dos microrganismos. O método de Gram se baseia no fato de que quando certas bactérias são coradas pelo o cristal violeta (corante azul) e depois tratadas pela solução de iodo – iodetada (lugol), forma-se um composto de coloração escura entre o iodo e o corante, que é fortemente retido por um grupo de bactérias e não pode ser removido pelo descoramento subsequente com o álcool – gram positiva. Outras bactérias, denominadas gram negativas, deixam-se descorar facilmente pelo álcool. Então, as bactérias gram negativas aparecerão coradas em vermelho, ao passo que as gram positivas aparecerão coradas em roxo.O mecanismo da coloração de Gram está relacionada com a permeabilidade da parede celular. As bactérias gram negativas apresentam uma elevada concentração de lipídeos e uma delgada parede celular quando comparadas com as bactérias gram positivas. Sugere-se que quando há o tratamento com álcool, os lipídeos das bactérias gram negativas são retirados da parede celular, aumentando a permeabilidade da mesma e fazendo com que estas bactérias percam o primeiro corante (cristal violeta). As bactérias gram positivas, por possuírem uma menor concentração de lipídeos, se tornam desidratadas com o tratamento pelo álcool, diminuindo a permeabilidade da parede celular e retendo o primeiro corante.

Esquema da parede celular bacteriana (Literatura)

Fig.1: Parede celular gram positiva Fig.2: Parede celular gram negativa.

MATERIAL NECESSÁRIO

Solução salina

Corantes: Cristal de Violeta, Lugol, Álcool-Acetona e Safranina(Fucsina)

Placas pré-cultivadas com S. aureus

Placas pré-cultivadas com E.coli

Óleo de imersão

Microscópios

Lâminas

Alças bacteriológicas

Estufa 37°C

TÉCNICA COLORAÇÃO DO GRAM

Em um lâmina de uso histológico pingar uma gota de solução salina estéril.

Recolher uma colônia pré-cultivada com alça bacteriológica.

Colocar a colônia selecionada junto à lâmina e homogeneizar (espalhar com a alça).

Fixar o esfregaço no calor (o processo tem que ser rapidamente)

Cobrir o esfregaço com Cristal Violeta por 1 min. Nota: após este passo, todas as células ficam coradas com o cristal de violeta.

Escorrer o corante e lavar com água. Secar com papel filtro, sem esfregar. Cobrir a preparação com reagente de Lugol e deixar atuar durante 1 min.

Escorrer a solução de Lugol, lavar com água e secar.

Descorar com Álcool Acetona até remover o excesso de corente. Nota: