Microbiologia Coloração De Gram

1 – OBJETIVO

Desenvolver habilidades para executar as técnicas de preparação de esfregaços e para o método de coloração de Gram, sabendo diferenciar e classificar as bactérias de acordo com a coloração obtida, observando as mesmas no microscópio óptico, após a coloração de Gram.

2 – INTRODUÇÃO

A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 por Hans Christian Joaquim Gram, médico bacteriologista dinamarquês. É um procedimento de coloração diferencial e muito útil, pois permite distinguir os dois principais grupos de bactérias: Gram-positivas e Gram-negativas, de acordo com diferenças na parede celular das bactérias. Esta técnica é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo utilizada como técnica de rotina em laboratórios de Microbiologia e Análises Clínicas.

Consiste no tratamento sucessivo, no esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com reagentes:

• Corante primário – cristal violeta: cora o citoplasma de púrpura independentemente do tipo de célula.

• Mordente – solução de Iodo (Lugol): aumenta a afinidade entre o cristal violeta e a célula e forma com o corante um complexo insolúvel dentro da célula.

• Agente descolorante – álcool, acetona ou ambos: solvente lipídico.

• Contrastante – safranina ou fucsina básica: cora o citoplasma de vermelho.

Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo diferente á coloração de Gram. Ao microscópio, as células gram-positivas aparecerão coradas em violeta e as gram-negativas em rosa.

As bactérias Gram-positivas apresentam uma parede espessa, homogênea, geralmente não estratificada e predominantemente constituída por peptideoglicano. Deste modo, o precipitado insolúvel que se forma por ação do mordente, fica retido no interior da célula pela camada espessa de peptidoglicano, logo, estas células não são descoradas permanecendo com a coloração conferida pelo corante primário (púrpura).

As bactérias Gram-negativas apresentam uma parede estratificada constituída por uma membrana externa e por uma camada mais interna que contém peptideoglicano e que é mais fina que a das Gram-positivas. Deste modo, o precipitado insolúvel, que se forma por ação do mordente, é removido (camada de peptidoglicano é mais fina que a das Gram-positivas e a membrana externa são parcial ou totalmente solubilizadas pelo agente descolorante), pelo que as células ficam descoloradas, corando de vermelho pelo contrastante.

Desta forma, a diferente estrutura da parede bacteriana e, em particular a espessura da camada de peptidoglicano, é a responsável pelo diferente comportamento das bactérias face à coloração de Gram.

Porém, os resultados da coloração de Gram não são universalmente aplicáveis, pois algumas células bacterianas coram-se fracamente ou não adquirem cor. A reação de Gram é mais consistente quando usadas em bactérias jovens, em crescimento. Em células de bactérias gram-positivas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como gram-negativas. Portanto, o uso de amostra nova é importante.

3 – PARTE EXPERIMENTAL

3.1 – Materiais:

• Alça de Platina

• Lâminas de vidro

• Pipetas de Pasteur

• Suporte para coloração das lâminas

• Placa com crescimento bacteriano: E.Coli e S.aureus (1° aula prática), Salmonella e uma cultura mista (2° aula prática).

3.2 – Reagentes:

• Água

• Álcool

• Cristal Violeta

• Lugol

• Fucsina

3.3 – Equipamentos:

• Microscópio óptico

• Bico de Bunsen

3.4 – PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Inicialmente foi preparado o esfregaço na lâmina. Com ajuda do bico de Bunsen flambou-se a alça de platina, logo em seguida inseriu-se uma gota de água no centro da lâmina, após flambou-se novamente a alça a fim de coletar uma amostra da cultura escolhida (a amostra não deve ser coletada com alça quente por isso é necessário o resfriamento da alça no lado da colônia), com a alça fria a amostra foi coletada e espalhada sobre a gota de água contida na lâmina fazendo com que o esfregaço fique uniforme e fino na região central da lâmina. Após os procedimentos realizados foi necessário que o esfregaço secasse a uma distância da chama, e para a fixação do esfregaço a lâmina foi passada lentamente sobre a chama por três vezes. Depois de aguardar um tempo e a lâmina atingir a temperatura ambiente