Westerning Blooting

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos

Departamento de Ciências Básicas

Aula Prática 02 – Bioquímica Fundamental (ZAB0361)

Western Blotting

Mariana Brustello

Professor Doutor Marcelo de Cerqueira Cesar

Pirassununga – SP

Maio/2014 

Sumário

1. Resumo 1

2. Introdução 1

3. Materiais 6

4.Metodologia 6

4.1 Preparo da amostra do músculo do peixe 6

4.2 Protocolo de transferência do método de Western Blotting...........................6

4.3 Preparo para detecção da proteína de interesse no método de Western Blotting.....................................................................................................................7

5. Resultados e Discussões 8

6. Conclusão 14

7. Referências Bibliográficas 14

1. Resumo

O Western Blotting (WB) é um método de alta sensibilidade e especificidade utilizado para identificação de proteínas de tecidos biológicos através da imunoidentificação. Essas proteínas são separadas por eletroforese em gel, onde as proteínas presentes nos tecidos são transferidas para o gel. Após esta etapa, as proteínas do gel passam para uma membrana de nitrocelulose, a partir do mesmo princípio da eletroforese. Em seguida, é adicionado o anticorpo primário específico para a proteína de interesse a ser identificada, neste caso a miosina de cadeia leve. Também é adicionado um anticorpo secundário a membrana, que se ligará ao anticorpo primário. O anticorpo secundário normalmente esta anexado a uma enzima reveladora, que ao entrar em contato com o reagente de cor, adicionado em seguida a membrana, proporciona uma reação de cor revelando a existência ou não da proteína de interesse.

2. Introdução

A técnica de Western Blotting (WB) foi desenvolvida no laboratório do Prof.º George Stark na Universidade de Stanford. O nome Western Blotting foi dado por W. Neal Burnette, e é um trocadilho para o nome Southern Blotting, técnica para detecção de DNA desenvolvida anteriormente por Edwin Southern. Também há uma técnica chamada Northern Blotting que serve para a detecção de RNA. Western Blotting é um método em biologia molecular/bioquímica para detectar proteínas em um homogenato (células trituradas) ou em um extrato de um tecido biológico.

Esta técnica é um poderoso e importante método em biologia molecular utilizado para imunodetecção de proteínas após a separação destas por eletroforese em gel e transferência para membrana adsorvente (KURIEN & SCOFIELD, 2006). Ela permite detectar, caracterizar e quantificar múltiplas proteínas, principalmente aquelas que estão em baixas quantidades em determinada amostra (KURIEN & SCOLFIELD, 2003). A técnica de WB oferece as seguintes vantagens: membranas úmidas são maleáveis e de fácil manuseio; as proteínas imobilizadas na membrana são rapidamente e uniformemente acessíveis a diferentes ligantes; somente uma pequena quantidade de reagentes é necessária para a análise de transferência; é possível fazer múltiplas réplicas do gel; o armazenamento da amostra transferida pode ser prolongado, antes de ser usada e a mesma proteína transferida pode ser usada para múltiplas análises sucessivas (KURIEN & SCOFIELD, 2006).

Desde seu início, a técnica de Western Blotting tem evoluído constantemente e agora a comunidade cientista está diante de múltiplos caminhos e significados da transferência e detecção de proteínas. O protocolo básico de WB pode ser resumido nos seguintes passos: preparação das amostras e fracionamento de proteínas, execução da eletroforese em gel, transferência das proteínas separadas do gel para uma membrana adsorvente, bloqueio de ligações inespecíficas, adição de anticorpo específico e detecção da reação.

A preparação de amostras é um dos passos cruciais do processo de separação de proteínas. Os resultados do experimento dependem das condições iniciais do material. Por esse motivo, um modelo experimental adequado e uma preparação cuidadosa de amostras são essenciais para se obter resultados significantes e confiáveis, particularmente em estudos comparativos de proteínas, em que normalmente existem diferenças mínimas entre as amostras experimentais e as do grupo controle (FREEMAN & HEMBY, 2004; BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).

A eletroforese é um processo analítico de separação de proteínas e outras moléculas, em que a migração de partículas acontece em um campo elétrico (matriz). Para tal evento é necessário que essas partículas sejam dotadas de carga elétrica (VESTERBERG, 1989). Laemmli foi o idealizador da técnica em 1970 quando a utilizou com a finalidade de determinar a mobilidade das proteínas em gel submetido à corrente elétrica. A mobilidade esta relacionada diretamente ao tamanho da proteína.

Outro fator que influencia na mobilidade ante ao gel, é o tamanho dos poros do mesmo. Para melhor resolução de peptídeos de pesos moleculares abrangendo uma faixa maior, é comum a utilização de gradiente do gel, de 5% a 20%, por exemplo. Desse forma, as proteínas grande ficam retidas no início da corrida e os pequenos peptídeos irão migrar até o final do gel na eletroforese.

A amostra de proteínas que será aplicada no gel é tratada para estar solubilizada e também é desnaturada com a quebra das pontes dissulfeto, forças eletrostáticas e pontes de hidrogênio. Na solução de tratamento da amostra podem ser utilizados agentes dissociantes (Uréia, EDTA), redutores (2-mercaptoetanol, ditiotreirol) e detergentes aniônicos (SDS, desoxicolato de sódio) e, em algumas situações, detergentes não-aniônicos são utilizados (Tween 20, Triton X-100). A amostra também é aquecida em banho até fervura por 5 minutos, geralmente, para garantir a melhor discriminação