A Biologia Molecular Prática
Por: Almir Gomes • 21/9/2023 • Relatório de pesquisa • 2.645 Palavras (11 Páginas) • 53 Visualizações
UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUBÁ[pic 1][pic 2]
INSTITUTO DE RECURSOS NATURAIS
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS
Biologia Molecular Prática – EBP014.2
COMPARAÇÃO DE DIFERENTES MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Itajubá, 22 de Maio de 2023.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUBÁ[pic 3][pic 4]
INSTITUTO DE RECURSOS NATURAIS
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS
Biologia Molecular Prática – EBP014.2
COMPARAÇÃO DE DIFERENTES MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Itajubá, 22 de Maio de 2023.
- INTRODUÇÃO
Ácidos nucleicos são moléculas complexas encontradas no núcleo das células podendo ser dívida em duas unidades, os ácidos desoxirribonucleicos (DNA) e os ribonucleicos (RNA), que estão envolvidos na transmissão, armazenamento e processamentos das informações genéticas de uma célula. A partir desses processos as células são capazes de preservar e transferir informação genética para as seguintes gerações por meio da complementariedade das moléculas de DNA e RNA (OLIVEIRA et al., 2007).
Devido à complexidade organizacional entre os organismos o processo de extração de ácidos nucleicos pode se diferir de forma significante entre organismos eucariontes (que apresentam DNA dentro no núcleo) e procariontes (que apresentam DNA no citoplasma da célula), ainda dentro das células eucariontes existe a diferença entre células animais e vegetais dada pela presença de parede celular, plastos, vacúolo de suco celular e glioxissoma nas células vegetais, fator que torna o processo de extração mais minucioso para estas.
- OBEJTIVOS
O presente relatório tem como objetivo apresentar e diferenciar os métodos de extração de ácidos nucleicos de células eucariontes (animal e vegetal) e procariontes, assim como demonstrar o motivo pelo qual cada protocolo se difere um do outro.
- METODOLOGIA
O processo de extração de ácidos nucleicos pode ser resumido em duas etapas, o processo de lise celular, que resulta na dissolução da parece celular pelo rompimento da membrana plasmática e a purificação do DNA, onde o DNA deve ser separado dos restos celulares e das proteínas, precipitado e suspenso em água mili-Q ou em um tampão de extração para futuras análises.
No presente experimento foram realizadas quatro extrações, duas para células animais com protocolos distintos, uma para células vegetal e uma para célula procarionte.
- Extração de ácidos nucleicos de abelhas
Esse processo se deu início pela maceração de uma abelha em nitrogênio líquido com o auxílio de um gral e pistilo de porcelana, a abelha foi macerada ate se formar uma espécie de pó e à ele foi adicionado um tampão de extração (TE) composto por 180ml de brometo de cetil trimetil amônio 2%, 40ml de EDTA 0,5 mol Ph 8, 180ml de NaCl 5 mol, 100ml de Tris-HCl 1 mol Ph 8 e 180ml de água mili-Q, essa solução foi então transferida para um microtubo de 2ml e incubada a 60ºC por 15 minutos, fazendo-se necessário a agitação dos tubos a cada intervalo de 5 minutos. Após o aquecimento foi adicionado uma medida de 1:1 de clorofórmio a solução e mantida em gelo por 10 minutos invertendo-os algumas vezes.
As soluções foram então centrifugados por 8 minutos a 10.000 rpm resultando em uma mistura não homogênea de duas fases, o sobrenadante foi então transferido para um novo microtubo, esse sobrenadante sofreu o mesmo processo de adição de clorofórmio 1:1, foi mantido em gelo por 10 minutos e novamente foi centrifugado a 10.000 rpm por 8 minutos resultando em uma segunda mistura não homogênea de duas fases, esse segundo sobrenadante foi transferido a um microtubo limpo e à ele foi adicionado isopropanol e reservado em freezer.
Após algum tempo esse microtubo foi centrifugado a 12.000 por 15 minutos e após a centrifugação foi notado um pellet no fundo do microtubo, a solução foi então descartada e o pellet foi lavado com etanol 70% e deixado para secar à temperatura ambiente, o pellet seco foi então ressuspendido em 100 microlitros de TE e reservado no freezer para análise futura.
- Extração de ácidos nucleicos de material preservado
Para essa extração foi implementado o protocolo patenteado do Kit DNeasy Blood & Tissue em uma larva.
Nesse procedimento nossa amostra de material preservado foi macerada em 180 microlitros do buffer ATL dentro de um tubo de ensaio com o auxílio de um bastão de vidro, após a maceração 200 microlitros do buffer AL foram adicionados e misturados e vórtex. A amostra foi incubada a 56ºC por 10 minutos e 200 microlitros de etanol absoluto foram adicionados, a mistura foi pipetada na coluna do kit em um microtubo de 2ml e centrifugada a 8.000 rpm por 1 minuto.
Após a centrifugação o tubo de fluxo e coleta foi descartado juntamente com a mistura que nele se encontrava e a coluna de centrifugação foi adicionada em um novo microtubo, ao novo microtubo foram adicionados 500 microlitros do Buffer AW1 e a mistura foi centrifugada a 8.000 rpm por 1 minuto, o microtubo foi descartado juntamente com a solução que nele se encontrava e a coluna de centrifugação foi posta em outro microtubo no qual 500 microlitros de Buffer AW2 foram adicionados e a mistura foi mais uma vez centrifugada a 14.000 por 3 minutos, o microtubo foi descartado e a coluna de centrifugação transferida para um microtubo de 1,5ml.
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