Identificaçao De Enterobacterias

PROVAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS GRAM-NEGATIVOS

Esta aula tem como objetivo a identificação de enterobactérias em gêneros ou espécies, através da utilização de meios de cultura especiais que possibilitam a verificação da presença de enzimas bacterianas relacionadas ao metabolismo de vários substratos. As alterações nos meios produzidas pelo metabolismo bacteriano servirão de base para sua identificação de acordo com o esquema a seguir:

1) PLAQUEAMENTO SELETIVO

É a etapa de isolamento bacteriano a partir do espécime clínico, utilizando meios seletivo-indicadores como o Agar EMB. A presença dos corantes eosina amarela e azul de metileno inibem as bactérias Gram positivas. Ao prepararmos este meio, a eosina e o azul de metileno reagem e formam o eosinato de azul de metileno (sal). As bactérias Gram negativas que fermentam lactose (LAC+) e, consequentemente, produzem ácidos que dissociam este sal, apresentando-se como colônias rosa-avermelhadas com ou sem um centro negro, devido ao azul de metileno, enquanto as não fermentadoras (LAC-) formam colônias transparentes.

2) CONFIRMAÇÃO BIOQUÍMICA

É um conjunto de provas bioquímicas necessárias para a identificação das colônias suspeitas. Serão utilizados os meios abaixo. Estes meios totalizam oito testes que somados ao da fermentação da lactose permitem identificar com fidelidade a grande maioria das enterobactérias isoladas em espécimens clínicos.

A) Meio EPM

O meio EPM contém os testes de fermentação e produção de gás a partir de glicose, produção de H2S, hidrólise da uréia e desaminação de triptofano.

B) Meio MILi

O Meio MILi contém os testes de motilidade, indol e descarboxilação de lisina.

C) Citrato de Simons

Este teste permite identificar espécies que utilizam citrato como única fonte de carbono.

2.1) Fundamento teórico:

• Hídrólise da uréia: Este teste verifica a habilidade de um microrganismo em utilizar a uréia, formando duas moléculas de amônia pela ação da enzima urease (uréia  2 NH3 + CO2 + H2O).

• Motilidade: O teste visa verificar se a bactéria é móvel ou imóvel. Logo pode ajudar na diferenciação de alguns gêneros como por exemplo Enterobacter (usualmente +) e Klebsiella (-). A mobilidade das bactérias é proporcionada pela presença de um ou mais flagelos. As bactérias imóveis não possuem flagelos.

• Produção de indol: Este teste tem como princípio determinar a habilidade de um microrganismo em produzir indol a partir da molécula de triptofano. Pode ajudar na diferenciação de alguns gêneros de bactérias como, por exemplo: E. coli (usualmente +) do grupo Klebsiella-Enterobacter (-).

• Citrato de Simmons: Este teste visa determinar se um microrganismo é capaz de utilizar citrato como uma única fonte de carbono para o seu metabolismo, resultando em uma alcalinidade no meio. As bactérias citrato positivas crescem usando sais de amônia como fonte de nitrogênio, liberando amônia e conseqüentemente deixando o meio alcalino. O indicador de pH é o azul de bromotimol, que em meio ácido fica amarelo e em meio básico, azul.

• Produção de H2S: Este teste visa determinar a capacidade de produção de íons S-2 a partir do metabolismo bacteriano.

• Produção de gás: Este teste visa determinar a capacidade de produção de gás CO2 a partir da fermentação da glicose.

• Descarboxilação de lisina: Este teste visa determinar a capacidade de descarboxilar a lisina, por ação da enzima lisina descarboxilase.

2.2) Procedimento:

Tocar a colônia com agulha bacteriológica e semear os 3 meios na seguinte ordem: Citrato, EPM e MILi. Para inocular o meio de citrato deslizar a agulha pelo centro estriando toda a superfície inclinanda. No meio EPM introduzir a agulha até o fundo do tubo e ao retirá-la semear a superfície do meio enquanto o MILi deve ser semeado por picada central que deve atingir o fundo do tubo.

2.3) Leitura e interpretação:

A) Meio EPM:

• Produção de gás: Aparecimento de bolhas ou deslocamento do meio de cultura do fundo do tubo.

• Produção de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade.

• Hidrólise da uréia: Aparecimento de cor azul ou verde azulada (reação fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou não.

• Desaminação do triptofano: Aparecimento de cor verde-garrafa na superfície do meio.

B) Meio MILi

• Motilidade: