Transformação de bactérias quimiocompetentes (método PEG)

Transformação de bactérias quimiocompetentes (método PEG)

1. Material

Células quimiocompetentes

Tampão de transformação (Transfo buffer)

1mL 10X KCM (1M KCl, 0,3M CaCl2, 0,5M MgCl2)

1,5mL PEG 10% (w/v, 6000 ou 4000)

7,5mL H20

1. Procedimentos

• Descongelar as células competentes em gelo;
• Misturar a ligação (cerca de 20μL) com 80μL de Transfo buffer e manter no gelo (pode-se usar diferentes quantidades de ligação, desde que seja mantida a proporção em relação à quantidade de tampão em relação ao volume final da transformação);
• Adicionar 100μL de células competentes e manter em gelo por 15 – 30 min.;
• Incubar a temperatura ambiente por 10 min.;
• Adicionar 1mL de LB e incubar a 37oC por 50 min.;
• Plaquear em placas com meio de cultura e o antibiótico apropriado.

1. Referência

Avi Levy, 1991.

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Preparo de células competentes de E. coli para transformação por PEG

        Durante este protocolo, as células devem permanecer tão resfriadas quanto possível.

        1-) Comece com uma única colônia;

        2-) Cresça a colônia em 5 mL de meio (2xTY, LB, CG) overnight;

        3-) Dilua a cultura 1:100 em 10 mL de TYM (100 uL para 10 mL) num erlenmeyer;

        4-) Cresça a solução de 10 mL até uma O.D.600 = 0,2 – 0,6;

        5-) Verta a solução anterior em um erlenmeyer com 40 mL de TYM;

        6-) Cresça estes 50 mL até O.D.600 = 0,5 – 0,9;

        7-) Verta em um erlenmeyer com 200 mL de TYM;

        8-) Cresça a solução de 250 mL até O.D.600 = 0,6;

        9-) Resfrie rapidamente em banho de gelo / água;

        10-) Centrifugue as células a 2000 x g e 4º C por 15 minutos, em tubos resfriados;

        11-) Ressuspenda gentilmente em 100 mL de TBF1 gelado;

        12-) Centrifugue as células a 2000 x g e 4º C por 8 minutos em novos tubos resfriados;

        13-) Ressuspenda gentilmente em 10 mL de TBF2 gelado;

        14-) Aliquote em tubos de 1,5 mL, tampe e jogue em nitrogênio líquido;

        15-) Guarde a –80º C.

        Notas:

Este protocolo prevê células suficientes para 100 transformações.

        A –80º C, as células podem ficar guardadas por aproximadamente seis meses.

TBF1                            g/L                TBF2                             g/L                TYM                g/L