RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA DE BIOLOGIA MOLECULAR
Por: jessicaalvr • 9/12/2018 • Trabalho acadêmico • 1.822 Palavras (8 Páginas) • 565 Visualizações
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE FARMÁCIA
AMANDA BOMFIM
BRUNA RABELLO HAJJAR
GEOVANE PEREIRA ARAÚJO
HUGO SANTIAGO FRANCISCO DA SILVA
JADE DE OLIVEIRA MELO
JESSICA ALVES RODRIGUES
LETÍCIA RIBEIRO MARIANO
LORRAYNE SIQUEIRA CHAVES
NATÁLIA ALVES PIRES DE CAMPOS
TATIANY MENEZES MACHADO
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA DE BIOLOGIA MOLECULAR
EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE PROTEÍNAS EM SDS-PAGE
GOIÂNIA, GO
2016
AMANDA BOMFIM
BRUNA RABELLO HAJJAR
GEOVANE PEREIRA ARAÚJO
HUGO SANTIAGO FRANCISCO DA SILVA
JADE DE OLIVEIRA MELO
JESSICA ALVES RODRIGUES
LETÍCIA RIBEIRO MARIANO
LORRAYNE SIQUEIRA CHAVES
NATÁLIA ALVES PIRES DE CAMPOS
TATIANY MENEZES MACHADO
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA DE BIOLOGIA MOLECULAR
EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE PROTEÍNAS EM SDS-PAGE
Relatório de aula prática apresentado a matéria de Biologia Molecular ao curso de Farmácia da Universidade Federal de Goiás sob a orientação do Profa. Dra. Célia Maria.
GOIÂNIA, GO
2016
- INTRODUÇÃO
As proteínas são macromoléculas formadas pela união de aminoácidos, que são compostos originados da ligação peptídica entre um grupo amino e um grupo carboxílico. As proteínas se apresentam em estruturas primarias, secundarias, terciarias ou quaternárias.
Existem muitas proteínas diferentes na célula. Para observar as características de uma proteína é necessário apenas uma amostra que contém o tipo de molécula que deseja ser analisada. A purificação dessa proteína consiste em etapas necessárias que devem ser realizadas para obter a proteína separada de outros contaminantes.
Podemos encontrar vários tipos de extração, sendo sua escolha variada de acordo com a localização da proteína. Para proteínas localizadas no citosol utilizamos o método mais simples, o de lise osmótica, que causa apenas o rompimento das células através da suspenção em uma solução hipotônica.
Para células com parede celular, pode – se utilizar enzimas, como a enzima lisozima, ou até mesmo detergentes ou alguns solventes tomando assim o cuidado para não desnaturar as proteínas de interesse. Existem também métodos mecânicos de lise celular que podem ser utilizados, são eles: o uso de um homogeneizador, uma prensa francesa ou um sonicador.
Para as proteínas que estão em complexos subcelulares, uma purificação do material é necessária, e pode ser realizada através de uma centrifugação diferencial. Temos também outros métodos de extração e purificação de proteínas, o salting out que consiste na extração de proteínas por meio de soluções salinas concentradas, a dialise que ocorre ao retirar o sal que está aderido as proteínas, e a cromatografia que pode ser em três tipos, a de troca iônica, de gel filtração ou de afinidade.
O tipo de extração utilizada foi o de eletroforese em gel de policramida, onde as proteínas migram de acordo com o tamanho e a forma. A proteína é desnaturada, as subunidades se separam pelo tamanho em um campo elétrico e as moléculas menores migram mais rapidamente através da matriz porosa do gel.
A análise proteica visa a alteração da composição de bases ou códons do gene para melhorar sua expressão, visa na introdução de alterações especificas nas sequencias de DNA e visa também a produção de proteínas totalmente novas.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
A extração e analise de proteínas em SDS-PAGE, foi feita a partir da extração de proteínas citoplasmáticas de P.brasiliensis. Na qual também foi realizado procedimento de preparo de reagentes e soluções em eletroforese unidimensional de proteínas.
2.1 Extrações de proteínas de P. brasiliensis
Foi realizado o crescimento das células em meio solido de Agar Fava Neto a 37°C para o crescimento da fase estacionária. Após o crescimento foi raspado as células do meio sólido e transferido para o meio liquido Fava Neto (utilizando uma proporção de ), e foi mantido sob agitação 150rpm a 37°C até que o crescimento fúngico até que alcance a metade da fase exponencial. A seguir a cultura foi transferida para fálcons de 50 ml e centrifugada por 10 min a 3000rpm a 4°C. A seguir a centrifugação foi ressuspenso em solução tampão PBS para fazer a lavagem das células, ocorrendo outra centrifugação para analise transcricional e foi retirado o sobrenadante para proceder à extração. Foram adicionadas as beads de extração e o Tampão Tris-Cálcio contendo inibidores de protease e também um mix de nucleases e foi levado em aparelho beadbeader para realizar a lise celular. Em seguida a lise foi adicionada perolas de vidro para ajudar na extração, foi agitado em vórtex e armazenado no gelo. Após foram transferidos para tubos limpos e estéreis de 1,5 mL e centrifugado a 10.000rpm a 4°C. Posteriormente a centrifugação foi transferido o sobrenadante para outro tubo limpo de 1,5 mL e armazenado a -80°C.[pic 1]
2.2 Preparo de reagentes e soluções
- 2.2.1 Tampão da amostra
Tris-HCl 1M (ph6,8) 2mL
SDS 10% 4mL
β-Mercapetanol 2mL
Glicerol 2mL
Azul de bromofenol traços
- 2.2.3 Ágar 2%(p/v)
Ágar 2g
H2O destilada (q.s.p) 100mL
- 2.2.4 Solução Bis-Acralimamida
Acrilamida 39g
Bis-Acrilamida 1g
H2O bidestilada (q.s.p) 100mL
- 2.2.5 Solução Tris-HCl 2,0 M pH 8,8
Tris-base 24,1g
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