A diluição em série para medir e isolar microrganismos

AULA PRÁTICA 07

DILUIÇÃO SERIADA PARA QUANTIFICAÇÃO E ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

1. Introdução

Como resultado do pequeno tamanho dos microrganismos, a quantidade de informação que pode ser obtida a partir do estudo de um único indivíduo é limitada. A grande maioria dos microbiologistas estuda populações, contendo milhões ou bilhões de indivíduos. Tais populações são obtidas pelo crescimento dos microrganismos em condições mais ou menos bem definidas, na forma de culturas. Uma cultura que contém apenas um tipo de microrganismo é conhecida como uma cultura pura ou axênica. Uma cultura que contém mais de um tipo de microrganismo é conhecida como uma cultura mista.

A população microbiana ambiental é grande e complexa. O estudo dos microrganismos que habitam os diversos ambientes (ar, água, solo) requer o conhecimento dos tipos específicos de microrganismos que ali se encontram. Isto, por sua vez, requer técnicas capazes de separar as espécies distintas na forma de culturas puras a partir de culturas mistas.

Na microbiologia existem dois tipos de operações:

Isolamento: a separação de um determinado microrganismo de uma população mista existente na natureza;

Cultivo: o crescimento de populações microbianas em ambientes artificiais (meio de cultura) sob condições de laboratório.

Estas duas operações são realizadas independentemente do tipo de microrganismo com o qual o microbiologista lida. Elas são básicas para o estudo de viroses, bactérias, fungos, algas, protozoários e mesmo pequenos animais invertebrados.

A preparação de uma cultura pura envolve não apenas o isolamento de um dado microrganismo de uma população microbiana natural mista, mas também a manutenção do indivíduo isolado e sua progênie em um ambiente artificial. Existe uma variedade de técnicas através das quais as diferentes espécies de um espécime natural podem ser isoladas e desenvolvidas em cultura pura.

1. Técnica de enriquecimento: o processo de plaqueamento pode ser precedido pelo crescimento em um meio de enriquecimento para melhorar as chances de isolamento de alguns tipos fisiológicos.

2. Técnica da placa derramada (pour-plate): sucessivas diluições do inóculo são colocadas em placas de Petri estéreis e misturadas ao meio contendo ágar fundido, que logo em seguida solidifica. As colônias subsequentemente desenvolvem-se embebidas no ágar. Esta técnica pode ser usada para análises quantitativas e/ou qualitativas. Usando-se o processo quantitativo é possível determinar o número de um tipo de bactéria, por exemplo, presente no inóculo, assim como isolar esses tipos em cultura pura.

3. Técnica das diluições sucessivas: A técnica de diluição é muito útil quando se deseja saber quantas unidades formadoras de colônias (UFC) existem em uma suspensão bacteriana. Esta técnica pode ser aplicada quando se quer determinar, por exemplo, a população bacteriana ao longo do tempo, ou UFC de uma bactéria fitopatogênica presente em um extrato obtido de uma amostra de sementes.

A metodologia consiste na diluição progressiva da suspensão bacteriana, tomando-se uma pequena alíquota de uma suspensão mais concentrada, de onde se faz a transferência desta para uma solução salina esterilizada, com volume previamente determinado.

Normalmente numa população microbiana mista, a concentração de microrganismos é bastante elevada, sendo necessário fazer diluições sucessivas para adequar ao método de isolamento. Realizam-se quantas diluições forem necessárias para que crescam na placa de Petri um número final de colônias entre 30 e 300, o que facilitará a contagem e estimativa da população microbiana presente. A diluição pode ser realizada em tubos contendo água destilada esterilizada ou solução salina esterilizada.

2. Objetivo

Realizar a técnica de diluição seriada para quantificação de populações microbianas edáficas.

3. Material e métodos

Procedimento

Em nossa aula prática, quantificaremos a população microbiana de amostras de solo. A diluição inicial será feita com 1g de solo em 99mL de água (no Erlenmeyer). Portanto, já iniciamos com uma relação de 1g de solo em cada 100mL de solução: 1/100 (fator de diluição 102).

Deste Erlenmeyer, tomamos 1 mL e pipetamos no tubo A, que contém 9mL de água destilada. Aumentamos fator de diluição para 103.

Do tubo A, coletamos 1mL da solução e transferimos para o tubo B, que contém 9mL de água destilada. Desta forma, o fator de diluição no tubo B é de 104.

Do tubo B, coletamos 1mL da solução e transferimos para o tubo C, que contém 9mL de água destilada. Desta forma, o fator de diluição no tubo C é de 105.

Do tubo C, coletamos 1mL da solução e transferimos para o tubo D, que contém 9mL