Carta de motivos

Título do Projeto

Biogênese de corpúsculos lipídicos mediado por Sistema de Secreção do Tipo VI

Orientador(a):

Tatiana Amabile de Campos

Unidade/Departamento:

Departamento de Biologia Celular/IB

RELATÓRIO de ATIVIDADES

Data: 11/06/2015

Título do Plano de Trabalho

Biogênese de corpúsculos lipídicos mediado por Sistema de Secreção do Tipo VI

Aluno

Nayara Pessoa de Oliveira

Matrícula

12/0131277

Introdução

Sistemas de Secreção são complexos macromoleculares responsáveis pela inserção de proteínas e toxinas na célula alvo, assim mediando a interação do patógeno com a célula hospedeira (Brunet et al., 2014).O sistema de secreção mais recente descrito em bactérias gram-negativas é o do Tipo VI (T6SS). Este sistema está associado, em algumas espécies, a adesão celular, regulação gênica, conjugação e sobrevivência intramacrofágica (Silverman et al.,2012).

Uma estrutura fundamental para o T6SS é a proteína IcmF,localizada na membrana interna com domínios transmembranares, ela faz parte do transporte de proteínas efetoras para a célula alvo e ausência de sua expressão acarreta a diminuição da formação de biofilme, dificuldade para aderir a células epiteliais, perda de mobilidade e o decréscimo da replicação e viabilidade em macrófagos (Pace et al., 2011).Outras proteínas essenciais para o T6SS são a Hcp e Clpv.A Hcp é uma proteína da porção extracelular da célula e forma um hexâmero em forma de anel (Brunet et al., 2014).A Clpv é uma ATPase e está relacionada a contratilidade do sistema.(Ho et al., 2014)

Corpúsculos Lipídicos são organelas citoplasmáticas envolvidas no metabolismo lipídico, tráfico e sinalização celular e reserva lipídica (Barbosa et al., 2015).Em macrófagos elas são utilizadas para estocagem de ácido araquidônico ,precursor de lipídeos bioativos como prostaglandinas e leucotrienos, importantes mediadores inflamatórios (Walther et al.,2012). Presenças de certos patógenos induzem a biogênese de corpúsculos lipídicos no citoplasma da célula hospedeira.

A Interleucina 10 (IL-10) é uma citosina com grande potencial anti-inflamatório, tem papel fundamental na regulação da resposta a patógenos evitando uma resposta em grande escala que possa prejudicar a integridade do tecido. Alguns patógenos podem se aproveitar da capacidade imunomoduladora da IL-10 para evadir da resposta imune, causando uma inflamação persistente (Iyer et al,2012).A Interleucina 12 (IL-12 é  secretada principalmente por células fagocíticas em resposta a bactérias e patógenos intracelulares. Ela é responsável pela indução da síntese de Interferon ɣ (IFN-ɣ,),citosina que regula atividade e mobilidade de células fagocíticas e Natural Killers,sendo a principal mediadora das interações celulares durante os primeiros estágios do processo inflamatório (Trinchieri,2003)

 Neste trabalho, foi determinado o perfil de imunodulação de corpúsculos lipídicos pelo Sistema de Secreção Tipo VI de uma linhagem APEC.

2.Materiais e Métodos

2.1. Cultivo das Bactérias.

A linhagem SEPT362 isolada de um frango com colisepticemia, seus mutantes contendo uma deleção nos genes IcmF (∆icmF),Clpv (∆clpv) e Hcp (∆hcp) ( (De Pace et al., 2011)) foram cultivadas em 4mL de meio LB (NaCl  10g/L;  Triptona  10g/L; Extrato de Levedura 5g/L) por 18 horas a 37°C.

2.2. Infecção de Macrófagos Murinos.

Os macrófagos murinos da linhagem Raw foram cultivados (37ºC em atmosfera de 5% de CO2) em Meio Eagle Modificado com 10% de Soro Fetal Bovino em uma microplaca de 24 poços com lamínulas, cada poço contendo 1x106 células/mL. Após a adesão das células sobre as lamínulas, cada poço foi lavado 2 vezes com tampão PBS pH 7,4 para retirar as células que não aderiram e foi adicionado 1 mL do meio Eagle com 10% de Soro Fetal Bovino sobre as lamínulas. Em seguida, 50µL da suspensão de 2x106 células/mL em solução salina de cada linhagem bacteriana foram adicionadas nos poços, assim como um controle positivo para formação de corpúsculos lipídicos: lipopolissacarídeo  (LPS) e um poço foi mantido sem estímulo, como um controle negativo. Após 30 minutos de incubação a 37ºC,os poços foram lavados 3 vezes com tampão PBS pH 7,4 para retirar células e bactérias inviáveis.A seguir, 1mL de meio Eagle contendo  gentamicina  (50  g/ml)  foi  adicionado sobre cada  lamínula e a microplaca foi incubada a 37º C por 24 horas. Em seguida, o sobrenadante foi recolhido e armazenado para testes imunoenzimáticos (ELISA) e dosagem de óxido nítrico e as lamínulas foram fixadas com formalina 3,7% pH 7,4 e submetidas a coloração Oil Red.

2.3.Visualização da formação de Corpúsculos Lipídicos.

Após 10 minutos de fixação com formalina 3,7% pH 7,4, foram feitas 3 lavagens com PBS pH 7,4 nas lamínulas. Em seguida, elas foram incubadas com Propilenoglicol 100% por 2 minutos,após foi retirado o Proprilenoglicol e adicionado Oil Red 0,5%,que permaneceu sobre as lamínulas por 15 minutos. Em seguida,foi removido o Oil Red 0,5% e adicionado Propilenoglicol 60% por 1 minuto,e então as lamínulas foram lavadas 3 vezes com PBS pH 7,4 e depois coloridas com Hematoxilina por 10 segundos. A seguir, as lamínulas foram retiradas dos poços das microplacas e fixadas em uma lâmina com Entellan. As lâminas foram visualizadas em microscópio de luz e foram contados CL  em 50 células por lâmina de cada fator.

2.4. Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)

        As concentrações das citosinas IL-10 e IL-12 foram determinadas por ensaios enzimáticos (ELISA ) conforme as recomendações do fabricante.

2.5.Ensaio de sobrevivência in vivo

            Para avaliar a influência do T6SS na capacidade da APEC de colonizar o hospedeiro foram infectados camundongos da linhagem C57Bl6 com uma suspensão de 1x107 células/mL em solução salina de cada linhagem bacteriana. Após 24h de infecção, os camundongos foram sacrificados e tiveram seus fígados retirados. Os órgãos foram macerados por fricção, utilizando a superfície esmerilhada de lâminas de vidro e 100µL desse macerado foi espalhado em meio seletivo MacConkey.As placas foram encubadas overnight e contadas as Unidades Formado de Colônias (C.F.U).