ANÁLISE DA ATIVIDADE BIOCÍMICA DE ISOFORM PHOSPHOLIPASE-D

ANÁLISES DAS ATIVIDADES BIOQUIMICAS DAS ISOFORMAS DE FOSFOLIPASE-D

COM MUTAÇOES SITIO DIRIGIDAS DO VENENO DE ARANHA-MARROM

(LOXOSCELES INTERMEDIA)

Relatório Final apresentado à Coordenadoria de Iniciação Científica e Integração Acadêmica da Universidade Federal do Paraná das atividades de Iniciação Científica - Edital 2013.

Orientador: Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga/ Departamento de Biologia Celular

Avaliação bioquímica, biológica e biotecnológica dos venenos L. intermedia (aranha-marrom) e L. obliqua (taturana). Registro no BANPESQ/THALES: 2000008116

CURITIBA

2014

RESUMO

As aranhas marrons são uns dos maiores alvos de pesquisas pelos efeitos biológicos que seu envenenamento desencadeia. O loxoscelismo é resultado de várias toxinas presentes no veneno da aranha do gênero Loxoceles. As fosfolipases-D são enzimas as quais estão presentes no veneno e é uma das maiores responsáveis pelo quadro clínico resultante. Fosfolipases –D de Loxosceles tem a capacidade de hidrolisar lipídeos como esfingomielina presentes nas membranas celulares e dos eritrócitos. O estudo tem como intuito verificar os resíduos de aminoácidos que estão presentes na fenda catalítica atuando no reconhecimento, captura e hidrolise dos substratos (lipídios). Para isso usamos a técnica de mutagênese “in vitro” usando como molde a isoforma LiRecDT1 ,a qual consiste em substituir os resíduos de aminoácidos os quais foram prospostos a pertencerem a fenda catalítica em aminoácidos neutros.Os aminoácidos foram His¹²,His47, resíduos de Glu32 e Asp34, e resíduos de Lys93, Tyr228 e Trp230, estes foram os resíduos propostos a fazerem parte da fenda catalítica coordenando o íon Mg+2 e o processo de hidrolise do substrato. Com as isoformas recombinantes mutadas foram expressas em larga escala em sistema procarioto utilizando a cepa de bactérias Escherichia coli BL21(DE3)pLysS para todas as isoformas com mutação sítio-dirigida, posteriormente foi purificada pelo sistema de cromatografia de afinidade Ni+2 –NTA agarose.

Para analisar a participação dos aminoácidos foram feitos testes como esfingomielinase e hemólise. Para a avaliação da atividade esfingomielinásica foi utilizado o kit Amplex Red (Molecular Probes, Eugene, EUA). Como controle positivo foi utilizado LiRecDT1 e LiRecDT1H12A e no controle negativo apenas o reagente Amplex Red sem toxina.No kit há substâncias as quais na presença de fosfolipase-D desencadeiam uma série de reações químicas que resultam em um produto fluorescente.O controle negativo e o positivo foram encubados à 37ºC por 30 minutos, em pentaplicata. Observou-se que a isoforma controle LiRecDT1 obteve alta atividade em contra partida todas as isoformas com as mutações sitio dirigidas tiveram atividade reduzia.Na Hemólise utilizou-se 1 ml de sangue humano sadio .O controle positivo apresentou 100% de hemólise originada de 0,1% (v/v) Triton X-100 a qual permaneceu por 60 minutos a 37 ºC.As alíquotas que continham concentração de 25 μg/mL de cada toxina e 200 μL da suspensão de eritrócitos foram incubadas a 37°C em constante agitação por 24 horas, e posteriormente avaliada a porcentagem de hemólise das mutações sitio dirigidas.O resultado foi uma diminuição na atividade hemolítica das isoformas mutadas comparada com a LiRecDT1, exceto as isoformas LiRecDT1 C201A e LiRecDT1 W230A. Com isso pode-se dizer que os aminoácidos mutados fazem parte da fenda catalítica auxiliando na captura e hidrolise dos substratos. Esses substratos os quais são subprodutos que desencadeiam os efeitos biológicos do veneno.

1.0 OBJETIVOS

1.1 Objetivo Geral:

Análise da participação dos aminoácidos os quais são propostos a pertencerem a fenda catalítica fazendo o reconhecimento, captura e hidrólise de diferentes substratos.

1.2 Objetivos específicos:

• Subclonagem da isoforma LiRecDT1 em vetor de expressão com as seguintes mutações sítio-específicas: D32A-E34A, H12A-H47A, C53A-C201A, K93A, Y228A, W230A.

• Expressão de isoformas de LiRecDT1 com mutações sitio dirigidas em resíduos de aminoácidos,nos sítios-específicos: D32A-E34A, H12A-H47A, C53A-C201A, K93A, Y228A, W230A.

• Purificação das isoformas com mutações sitio dirigidas pelo sistema de cromatografia de afinidade Ni+2 –NTA agarose.

• Testes bioquímicos utilizando as isoformas mutadas a diferentes substratos lipídicos para a análise da especificidade a cada substrato.

• Aprofundar a compreensão do mecanismo molecular dos aminoácidos participantes da fenda catalítica.

2.0 INTRODUÇÃO

O veneno da aranha marrom é alvo de estudos pelos efeitos biológicos que seu veneno produz. Para isso já há vários estudos que direcionam para identificação dos constituintes dos venenos loxoscélicos e algumas toxinas presentes no veneno já foram elucidadas.(da SILVA et al., 2004; APPEL et al., 2005, CHAIM et al., 2011a). As aranhas marrons são estudas por resultarem em mais de 50 % dos acidentes os quais são originados por animais peçonhentos notificados no Estado do Paraná (DA SILVA et al., 2004; APPEL et al., 2005).O veneno loxoscelico pode desencadear sinais cutâneos e/ou sistêmicos. Pode iniciar-se com uma lesão necrótica com espalhamento gravitacional a qual é resultado de um quadro cutâneo, e até mesmo podendo atingir órgãos fazendo com que se desenvolvam distúrbios de hemóstase, com manifestações sistêmicas que podem desenvolver insuficiência renal aguda, levando o atingido a morte (CHAIM, 2012). No veneno há diversas toxinas e o nosso laboratório tem como objetivo aprofundar os estudos de cada uma. A fosfolipase-D é uma das toxinas que consegue desencadear todos os quadros clínicos que o veneno total pode ocasionar, sendo eles hemólise, agregação plaquetária, distúrbios renais,citotoxidade, nefrotoxidade e alterações na permeabilidade vascular ,coagulação intravascular disseminada, edema, dermonecrose e massiva resposta inflamatória(FUTRELL, 1992; da SILVA et al., 2004; APPEL et al., 2005; SWANSON e VETTER, 2006; TAMBOURGI et