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O Protocolo de Extração de DNA

Por:   •  23/4/2022  •  Ensaio  •  293 Palavras (2 Páginas)  •  97 Visualizações

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Protocolo para extração de DNA (Sangue)

  • Ligar a UV por 15 minutos (Ponteiras, pipetas, descartex).
  • Ligar o banho a seco à 56ºC.
  • Identificar os tubos com etiquetas: NOME, REGISTRO DO LIVRO, PRONTUÁRIO e DATA.

  1. Foram utilizadas 10 amostras de sangue anticoaguladas com EDTA, e 5 mL de cada amostra foram colocados em cinco tubos de vidro de 10 mL.
  2. Em seguida, 8 mL de tampão de lise (0,3 M de sacarose, 0,01 M de TrisHCl, pH 7,5, 5 mM de MgCl2, 1% Triton X100) foram adicionados a cada tubo.
  3. Os tubos foram centrifugados por 5 minutos a 2.500g.
  4. O sobrenadante foi descartado e 300m1 de TrisHCl 10 mM, pH 8, foi adicionado aos peletes.
  5. Os pellets foram liberados do fundo dos tubos e transferidos rapidamente para tubos de microcentrífuga frescos.
  6. O sedimento foi ressuspenso por agitação vigorosa e o produto foi centrifugado por 1 min a 700g.
  7. Após o descarte do sobrenadante, 330mL de TrisHCl 10 mM, pH 8; 330mL de lavanderia solução em pó (concentrações: 20, 25, 30, 35 e 40 mg/mL); e um grânulo de vidro foram adicionados a cada tubo.
  8. As amostras foram agitadas em vórtex por 1 min, 250mL de NaCl 6M foi adicionado e eles foram agitados novamente por 20 segundos.
  9. Em seguida, os tubos foram girados por 5 minutos a 15.000g.
  10. O sobrenadante foi transferido para tubos frescos (cerca de 750mL) e o DNA foi precipitado pela adição de 750mL de etanol 96%.
  11. O precipitado de DNA foi recuperado usando uma pipeta de vidro de extremidade fina selada a quente, lavada duas vezes em 0,5 mL de etanol a 70% e finalmente dissolvido em 100mL de TrisHCl 10 mM, pH 8.
  12.  O precipitado foi completamente dissolvido por incubação a 701C por 5 minutos.

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