Pcr Reaçao

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Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização

de Reações

BSc. Daniel Perez Vieira

(Protozoologia-IMTSP/ Laboratório de Biologia Molecular-IPEN)

Aula 1 - PCR: Princípios e tipos de Reação

Breve Histórico

Desenvolvida por Saiki, et al. (1985) e principalmente por Mullis, et al. (1987).

Kary Mullis, que percebeu que possuía uma importante ferramenta em mãos,

tentou publicar seus experimentos nas duas revistas científicas mais importantes

do mundo, a Science, americana, que prontamente lhe negou a publicação, e a

Nature, britânica, que procedeu da mesma forma. Mullis, resignado, conseguiu

publicar então seu artigo sobre amplificação do gene da β-globina humana na

Methods in Enzymology, de impacto infinitamente menor.

Apesar dos fracassos iniciais, a Perkin-Elmer Cetus, uma reconhecida empresa

de insumos para pesquisa comprou-lhe a patente, o que lhe rendeu bons lucros,

não antes de ser agraciado com o prêmio Nobel de Química em 1993.

Hoje a Perkin-Elmer repassou os direitos à Roche Molecular Systems (valor da

compra: US$ 300.000.000,00), que possui todas as patentes envolvidas no

processo de PCR, inclusive as relacionadas aos termocicladores convencionais.

Porém, a tecnologia tornou-se tão difundida que o custo de pagamento da patente

tornou-se acessível às suas concorrentes, e a variedade de reagentes e aparelhos

atualmente no mercado é grande.

www.etall.hpg.com.br 2

Na verdade, Saiki já havia descrito a técnica, mas Mullis inovou: Conseguiu

especificidade na cópia de apenas segmentos específicos, introduzindo o conceito

de primer de PCR, e na utilização de uma DNA polimerase termoestável. Até

então, a precursora da PCR demandava grandes quantidades de enzima,

adicionadas a cada ciclo de amplificação. Além disso, desenvolveu-se vários

equipamentos para a automatização da adição da enzima após cada ciclo, todos

de custo elevadíssimo (os primeiros “termocicladores”). Mullis utilizou a então

recém descrita Taq, DNA polimerase termoestável isolada da bactéria de fontes

termais Thermus aquaticus. Esta enzima se mantém estável em temperaturas de

até 117ºC, com temperatura ótima de 72ºC. Estes dois passos tornaram a técnica

muito mais fácil de se realizar.

Porém, a realização manual dos ciclos de temperatura, banhando-se um rack de

tubos em vários banhos-maria de temperaturas diferentes, ainda constituía um

fator dificultante do processo. Em 1989, o DNA Thermal Cycler apareceu como o

primeiro termociclador automático. Até hoje, a maioria dos termocicladores

automáticos funciona com o mesmo princípio: aquecimento por resistências

elétricas e refrigeração com ventoinhas e tubulações em serpentina