Relatório lab. de Biologia Molecular - Mitocondria

INTRODUÇÃO

          A enzima NADH-desidrogenase, também denominada como complexo I da cadeia respiratória mitocondrial, catalisa simultaneamente a transferência exergônica de um íon hidreto do NADH para a ubiquinona (benzoquinona solúvel em lipídeos) e a transferência endergônica de quatro prótons da matriz para o espaço intermembrana. Apresenta 42 cadeias diferentes de polipeptídeos com um braço em forma de L na membrana e outro na matriz, apresentando uma flavoproteína contendo FMN e seis centros Fe-S. A enzima succinato-desidrogenase (o complexo II da cadeia respiratória mitocondrial) é o segundo ponto de entrada de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial, estando também envolvida no ciclo do ácido cítrico. Catalisa a transferência de elétrons do succinato para ubiquinona através de uma flavoproteína e vários centros Fe-S presentes em sua estrutura, porém não contribui com gradiente de prótons na mitocôndria.

   As enzimas oxido-redutases catalisam reações de óxido-redução e podem ser classificadas como oxidases quando a o O2 é o utilizado como aceptor. A enzima NADH oxidase catalisa a oxidação do NADH (com consumo de oxigênio) em NAD+ e peróxido de hidrogênio. Presente em neutrófilos e células vasculares normais, por exemplo, é constitutivamente ativa, com inibidores não específicos, além de estar aparentemente correlacionada com a regulação da função do óxido nítrico no organismo.  A succinato oxidase, na presença de oxigênio, oxida o succinato a fumarato.  

OBJETIVOS

         Avaliar a atividade das enzimas NADH oxidase e succinato oxidase por acompanhamento polarográfico do consumo de oxigênio na presença, ou não, dos inibidores (rotenona e malonato), como também determinar as atividades das enzimas NADH-desidrogenase e succinato-desidrogenase em espectrofotômetro utilizando-se o ferricianeto como aceptor de elétrons (na presença de antimicina A), acompanhando sua redução a 420 nm.

METODOLOGIA

         Para o rompimento das mitocôndrias isoladas, foram feitas sucessivas etapas de congelamento-descongelamento, evitando traumas mecânicos a organela e possíveis interferências na atividade das enzimas da cadeia respiratória. Inicialmente, estas foram congeladas em nitrogênio líquido e, em seguida, descongeladas rapidamente em banho-maria a 37ºC. O procedimento foi repetido mais 2 vezes. Ao longo dos experimentos, as mitocôndrias rompidas foram mantidas em banho de gelo .

Succinato oxidase e NADH oxidase

           Mitocôndrias rompidas (concentração de proteína em torno de 0,25 mg/ml) foram incubadas com tampão TRIS 20 mM, pH 7,4, a 37 ºC  e , em seguida, com os substratos NADH ou succinato para avaliação das atividades das enzimas NADH oxidase e succinato oxidase, respectivamente, por acompanhamento do consumo de oxigênio.  Também foram realizados testes na presença dos inibidores rotenona (para NADH oxidase) e malonato (para succinato desidrogenase), adicionados anteriormente aos substratos.

NADH-desidrogenase e succinato-desidrogenase

          Para avaliar a atividade destas enzimas utilizou-se o ferricianeto como aceptor de elétrons (na presença de antimicina A), permitindo que a redução do mesmo fosse acompanhada a 420nm em espectrofotômetro. Para a reação, as mitocôdrias rompidas (concentração protéica em torno de 1,0 mg/ml) foram incubadas com tampão TRIS 20mM pH 7,4,  antimicina A, ferricianeto de potássio, NADH ou succinato. Zerou-se o aparelho pra descontar a absorbância do NADH.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

• Cálculos

Considerando que 190 nmol/ml de O₂ corresponde a 17,1 cm (37ºC):

Velocidade do consumo de O₂ =  190 (nmol/ml) x (x cm) x [volume da incubação (ml)] /

                                                        G (cm) x mg de proteína mitocondrial

• NADH oxidase ( sem rotenona)

(Primeira repetição)Velocidade do consumo de O₂= 190 X 0,5 X 2,5  / 17,1 X 0,625 = 22,22 nmol de O₂/ min mg de proteína

(Segunda repetição) Velocidade do consumo de O₂= 190 X 0,7 X 2,5 / 17,1 X 0,625= 31,11 nmol de O₂/ min mg de proteína

Média: 26,66 nmol de O₂/ min mg de proteína

• NADH oxidase ( com rotenona)

(Primeira repetição)Velocidade do consumo de O₂= 190 X 0,3 X 2,5  / 17,1 X 0,625 = 13,33 nmol de O₂/ min mg de proteína

 (Segunda repetição) Velocidade do consumo de O₂= 190 X 0,3 X 2,5 / 17,1 X 0,625= 13,33 nmol de O₂/ min mg de proteína

Média: 13,33 nmol de O₂/ min mg de proteína

• Succinato oxidase ( sem malonato)

(Primeira repetição)Velocidade do consumo de O₂= 190 X 1,5 X 2,5  / 17,1 X 0,625 = 66,66 nmol de O₂/ min mg de proteína

 (Segunda repetição) Velocidade do consumo de O₂= 190 X  X 2,5 / 17,1 X 0,625= 53,33 nmol de O₂/ min mg de proteína

Média: 59,995 nmol de O₂/ min mg de proteína

• Succinato oxidase ( com malonato):  Não houve respiração, já que não houve consumo de O₂.

• Cinética da NADH desidrogenase

• Controle

6cm ----- 0,5 Abs                         6cm-----0,5 Abs

2cm -----     x                                1,4cm ---- x

 x= 0,166                                          x= 0,116

Média do delta Abs= 0,141

Tempo = 15s

ε = 1,04 cm ˉ¹ mMˉ¹

Abs = ε x C x 1 →   C=  delta Abs/ ε x 1

C = 0,141/ 1,04 = 0,136 mM

0,136 mM de ferricianeto ---- 1000 ml

                  x                     -----  0,017 ml ( foi a quantidade de mitocondria usada na reação....não sei se precisa explicar)

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