Rompimento Celula: Separação e Purificação de Produtos Biotecnológicos

                          Universidade Federal de São João Del-Rei[pic 1]

     Departamento de Química, Biotecnologia e Engenharia de Bioprocessos

           Disciplina: Separação e Purificação de Produtos Biotecnológicos

ROMPIMENTO CELULAR POR MOINHO DE BOLAS

Priscilla Amaral Nascimento – Matrícula: 154250001

Thamires Furtado Ribeiro – Matrícula: 164200071

02-09-2016

1. Introdução

Diversas operações unitárias são necessárias para separar e purificar componentes biotecnológicos, cada produto de interesse passará por procedimentos específicos afim de obter um melhor resultado final. A aplicação da biomolécula e sua localização são especificações necessárias para a escolha do melhor procedimento.

Quando a molécula de interesse está no meio intracelular, a primeira operação necessária é o rompimento da parede celular ou membrana celular. O mecanismo adotado para romper células depende do tipo de microrganismo empregado e ocorre após a etapa de separação e lavagem das células obtidas ao final do cultivo (PESSOA & KILIKIAN, 2005).

Para escolher o método de rompimento celular mais adequado, é necessário ter conhecimento da morfologia e tamanho da célula, ou seja, ter conhecimento sobre sua estrutura (CARNEIRO, 1996). A Saccharomyces cerevisiae é um fungo unicelular que apresenta parede celular rígida e altamente complexa, por possuir polissacarídeos, o que geralmente está relacionado às condições de cultivo em que foi submetida (RIO, 2004). Os Beta-glucanos e a quitina são os maiores responsáveis pela rigidez da parede celular e definem sua forma (GOMES, 2009). Conhecendo tais características, torna-se possível definir o método para rompimento da célula.

Os métodos de rompimento celular são divididos em métodos mecânicos como homogeneizador de alta pressão, moinho de bolas, prensa francesa e ultrassom e os não-mecânicos. Esses últimos subdividem-se em métodos químicos, como ação de detergentes e solventes, e físicos, como congelamento/descongelamento e choque osmótico (MONKS, 2015).

No entanto, os métodos mais abordados em escala laboratorial e industrial são os mecânicos e os métodos de rompimento químico, pois o enzimático é de difícil ampliação de escala, devido à dificuldade de monitoramento dos parâmetros adotados. (NEVES, 2003).

O método abordado no experimento foi o moinho de bolas. O moinho de bolas é um método de rompimento o mecânico que consiste na utilização de esferas de vidro em um recipiente cilíndrico contendo a suspensão celular (GARCIA, 2006). O choque das esferas com a biomassa promove transferência de energia e consequentemente o rompimento celular. Alguns fatores como tamanho das esferas, velocidade de agitação do moinho e a concentração de células interferem neste processo (LUCI et al., 2015).

2. Materiais e Métodos

Para realizar a prática de rompimento celular, utilizou-se um moinho de bolas com

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câmara horizontal, uma suspensão de 2 g de células de Saccharomyces cerevisae em 2 mL de solução tampão, obtendo uma concentração de 50% de células do volume da câmara. Em seguida, foram retiradas duas amostras (Amostra 1 e Amostra 2) de suspensão de células com diluição de 100 µL e adicionadas em dois tubos para dosar atividade proteica e contagem de células. Dessa forma, montou-se as câmaras do moinho de bolas utilizando a suspensão em questão com 70% do volume de esferas (2,85 gramas) e 30% do volume de solução de células (1,2 gramas). Ao pesar as câmaras, ambas obtiveram mesmo peso de 391, 7 gramas.

As Amostras 1 e 2 foram diluídas, obtendo uma concentração de 3,125% de Saccharomyces cerevisae, onde foi medida a absorbância a 600nm para definir a concentração celular e para determinar a quantidade de proteína total antes do rompimento acontecer.

Após o rompimento, as soluções das câmaras foram diluídas em uma concentração de 2,381% e posteriormente centrifugadas. Com o auxilio de uma pipeta, o extrato bruto foi transferido para tubos cônicos. Esta amostra foi centrifugada durante 8 min a 14000 rpm, em temperatura ambiente. Por fim, retirou-se o sobrenadante, que foi lido em espectrofotômetro a 280nm.

3. Resultados e Discussão

Tabela 1 - Parâmetros utilizados para rompimento de células de Saccharomyces cerevisiae em moinho de bolas pelos grupos 1 e 2.

Parâmetro	Grupo 1	Grupo 2
Tempo de rompimento (min)	7	8
Frequência (hertz)	20	15
Concentração de células (g/mL)	2	2
Volume adicionado a câmara (mL)	1,2	1,3
Volume de esferas (g)	2,85	2,88

Tabela 2 – Absorbância medida a 280 nm e a 600 nm, concentrações de proteínas e concentração de biomassa, correspondentes a absorbância.

Grupos	A 280 nm	Concentração de Proteínas (g/L)	A 600 nm	Concentração de Biomassa (g/L)
A R + Grupo 1	2,486	4,143	0,503	0,213
A R + Grupo 1	2,363	3,938	0,466	0,197

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D R + Grupo 1	2,838	4,730	0,450	0,194
D R + Grupo 1	2,749	4,581	0,392	0,164
A R + Grupo 2	0,742	1,236	0,452	0,190
A R + Grupo 2	2,689	4,481	0,356	0,148
D R + Grupo 2	2,194	3,656	0,539	0,229
D R + Grupo 2	2,858	4,763	0,412	0,173

*A R: antes do rompimento; D R: depois do rompimento.

Tabela 3 – Rendimento de biomassa.

Grupos	Concentração de proteína total liberada (g/L)	Concentração de biomassa residual (g/L)
Grupo 1	1,141	0,089
Grupo 1	1,105	0,167
Grupo 2	2,957	-0,205
Grupo 2	1,062	-0,168