Doenças Genéticas

DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS: MÉTODOS DE RASTREAMENTO

Uma ampla variação de técnicas são utilizadas para a identificação de doenças genéticas. Todos os métodos têm vantagens e desvantagens e requerem considerável habilidade e experiência para serem realizados. Não existe uma padronização ou preferência geral por um método, mas os laboratórios devem ser conhecedores das limitações e sensibilidade dos métodos por eles usados.

A apresentação a seguir é uma síntese das diferentes estratégias, baseadas na análise do DNA, utilizadas para o diagnóstico de doenças genéticas.

Doenças Genéticas: Padrões de Herança Simples ou Complexo

• Autossômicas Recessivas - os genes estão presentes nos autossomas e os indivíduos afetados tem duas cópias do gene mutante. Ex: Fibrose Cística.

• Autossômicas Dominantes - os genes também estão nos autossomas, mas basta uma cópia do gene mutante para causar a doença. Ex: Doença de Huntington.

• Ligadas ao Cromossomo X - os genes agem como mutações dominantes no sexo masculino. Ex: Distrofia muscular de Duchenne.

• Poligênicas ou Multifatoriais- resultam de mutações em genes diferentes ou surgem da interação de fatores ambientais com múltiplos genes. Ex: Doenças cardíacas coronárias, câncer e esquizofrenia.

Aconselhamento Genético

O aconselhamento genético é o conjunto de informações dado à família com relação ao risco de recorrência , prognóstico e possíveis tratamentos de uma determinada doença genética.

Testes Genéticos

• Citogenético

• DNA

• Metabólico

Métodos de Análise do DNA (Diagnóstico Molecular)

As técnicas mais comuns de diagnóstico molecular são:

• amplificação enzimática do DNA (PCR)

• digestão da fita de DNA genômico ou produto de PCR com enzimas de restrição

• separação eletroforética do DNA ou do produto de PCR

• hibridação do DNA ou fragmentos de PCR com sondas oligonucleotídicas.

Aplicações da PCR

1. A PCR permite a rápida amplificação de um gene específico ou de um exon de um determinado gene como a primeira etapa para rastreamento de mutações não caracterizadas:

• PCR para amplificações de exons específicos do DNA genômico

• RT-PCR para análise de transcritos

2. A PCR permite a rápida genotipagem de marcadores polimórficos:

• Como uma alternativa de RFLP pelo desenho de primers flanqueadores de sítio de restrição polimórfico, permitindo a amplificação da região do polimorfismo e digestão do produto da PCR com a enzima de restrição sítio específica.

• Pelo desenho de primers de seqüências que flanqueiam repetições em tandem ou seja Short tandem repeat polymorphisms (STRs), conhecidas como microssatélites, que são seqüências curtas de 1-4 nucleotídeos de comprimento, que se repetem diversas vezes em tandem e que geralmente são caracterizadas por muitos alelos.

3. A PCR pode ser usada para ensaio de mutações conhecidas

• A discriminação alélica pelo tamanho: pequenas deleções ou insersões em alelos que podem ser detectadas por PCR, por exemplo, deleções no alelo mais comum que causa a fibrose cística (DF508)

• A suscetiblidade a enzima de restrição: mutações que mudam um sítio de restrição podem ser detectadas como descrito anteriormente, pela digestão do produto de PCR com a enzima de restrição específica

4. PCR alelo-específico (teste de ARMS)

• Mutações conhecidas podem ser identificadas pelo desenho de três primers, um específico para o alelo mutante, o outro específico para o alelo selvagem e o terceiro é específico da região flanqueadora (conservada) do exon e que será o primer que vai encaminhar a amplificação da fita no sentido direto. O desenho é feito de maneira que o primer específico para o alelo mutante termina com a base mutada na extremidade 3’ e o primer específico para o alelo selvagem termina com a base normal em sua extremidade 3’, funcionando como uma sonda alelo específica. Este método é usado para detectar mutações específicas e foi chamado de sistema de amplificação de mutação refretária.

5. A PCR pode ser usada para rastreamento de mutações e polimorfismos de DNA

• A detecção de variação de seqüências no DNA é importante para a identificação de mutações que causam doenças em um determinado gene, bem como para a detecção de polimorfismos de DNA. Uma vez que uma grande fração das variações genéticas são devido às diferenças produzidas pela mudança de base única na seqüência de DNA, o uso de técnicas capazes de detectar substituições de uma única base quando se procura mutações e seqüências polimórficas foi um avanço tecnológico para a pesquisa destas variações. Alguns destas técnicas de rastreamento são: DGGE, SSCP, DHPLC.

Cromatografia Líquida Desnaturante de Alta Performance (DHPLC)

DHPLC é uma cromatografia líquida baseada no método de pareamento de íons em fase reversa sob condições desnaturantes. Seu princípio é:

• formação de heteroduplexes através da hibridação após o aquecimento e esfriamento dos produtos de PCR.

• separação dos heteroduplexes e homoduplexes sob condições parciais de desnaturação

Método Citogenético

A observação microscópica de cromossomos normais e anormais permitiram a construção de mapas citogenéticos do genoma de muitas espécies. Estes mapas mostram a localização relativa de características morfológicas dos cromossomos (ex; centrômeros, marcadores citogenéticos ou bandas) e lesões cromossômicas visíveis. O conceito

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