Técnica De Gram

A técnica de coloração de Gram consiste em expor as células bacterianas à seguinte sequência:

1) corante primário: violeta de cristal

É o primeiro a ser usado e cora todas as células de violeta.

2) mordente: lugol - solução de iodo

Este reagente é uma substância que forma um complexo insolúvel ligando-se ao corante primário. O complexo resultante serve para intensificar a cor do corante, ou seja, o lugol ajuda o cristal de violeta a penetrar nas células e a resistir à descoloração. Nas bactérias Gram positivo este complexo é mais difícil de ser removido do que nas bactérias Gram negativo.

3) descorante: álcool etílico a 95 %

Este reagente serve de solvente de lípidos e de agente desidratante das proteínas. Assim, a sua ação é determinada pela concentração lipídica das paredes celulares microbianas.

Nas células Gram positivo a concentração baixa de lípidos é importante para reter o complexo corante-mordente. Os lípidos são dissolvidos pela ação do álcool causando a formação de pequenos poros na parede celular. Mas estes são prontamente fechados pela ação desidratadora do álcool e como consequência o corante primário é difícil de ser removido e as células mantêm-se violetas.

Nas células Gram negativo a alta concentração de lipidos na membrana externa da parede celular é dissolvida pelo álcool, formando-se grandes poros na parede celular que não fecham apreciavelmente durante a desidratação das proteínas da parede celular. Isto facilita a libertação do complexo corante-mordente deixando as células incolores.

4) corante de contraste: safranina

Este é o último reagente a ser aplicado e cora de vermelho as células que foram previamente descoradas. Uma vez que as células Gram negativo ficaram descoradas elas podem agora absorver o corante de contraste. As células Gram positivo mantêm a cor do corante primário.

A diferença na coloração das bactérias Gram positivo e Gram negativo deve-se à resistência à descoloração pelo álcool:

Bactérias Gram positivo: são aquelas que retêm o corante inicial e aparecem coradas de violeta.

Bactérias Gram negativo: são aquelas que perdem o corante inicial quando lavadas com o álcool 95% e depois coram de vermelho com o corante de contraste.

Procedimento

Preparo do esfregaço:

1-Pegar uma lâmina limpa no recipiente, secar e flambar rapidamente na chama do bico de Bunsen;

2- Identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço;

3- Flambar a alça bacteriológica deixá-la esfriar e colocar na lâmina uma gota de solução salina fisiológica;

4- Flambar a agulha bacteriológica, deixar esfriar próximo a chama, abrir a placa com a cultura teste e tocar a colônia escolhida para retirada da amostra,

5- Esfregar o material com movimentos de rotação da alça bacteriológica, para se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme;