Cinética fermentativa

Roteiro da Aula Prática Nro. 5

1 . Título: Cinética enzimática

2. Objetivos:

• Estudar o efeito da concentração do substrato sobre a velocidade das reações enzimáticas, determinando o Km.

3. Parte experimental:

3.1.Aspectos teóricos

Nesta aula prática será utilizada a invertase (B.D. fruto-furanoside-frutohidrolase, 3.2.1.26). Esta enzima é de grande importância no desenvolvimento da cinética enzimática por ter sido a que Henri e Michaelis determinaram o efeito da concentração do substrato sobre a velocidade da reação enzimática.

O trabalho prático se realizará em duas etapas:

Primeira etapa: Reação Enzimática

Ação da invertase sobre o substrato (sacarose) dando como produtos frutose e glicose.

enzima

SACAROSE + H2O GLICOSE + FRUTOSE

Esta reação deverá ocorrer em exatos 5 min para que se possa avaliar a atividade da enzima. Neste intervalo de tempo a velocidade da reação para uma mesma concentração é constante.

Segunda etapa: Reação Colorimétrica

Após interrompida a reação enzimática com o reativo 3,5DNS, inicia-se simultaneamente a reação colorimétrica, ou seja, os produtos da reação enzimática (glicose e frutose) reagirão com o 3,5DNS para formar o 3,5DAS.

3,5DNS -------- Ácido 3,5 Dinitrossalicílico

3,5DAS -------- Ácido 3,5 Diaminossalicílico

3.2. Experimentos

Preparar 7 tubos seguindo o quadro abaixo:

TUBOS 1 2 3 4 5 6 B

Reagentes

Tampão Acetato pH 4,7 0,9ml 0,9ml 0,9ml 0,9ml 0,9ml 0,9ml 0,9ml

Sol. Sacarose 15mM 0,5ml

Sol. Sacarose 30mM 0,5ml

Sol. Sacarose 100mM 0,5ml

Sol. Sacarose 200mM 0,5ml

Sol. Sacarose 300mM 0,5ml

Sol. Sacarose 400mM 0,5ml

H2O destilada 1,5ml

Para obter um tempo de incubação de 5 min, adicionar em cada tubo 0,1 ml da enzima invertase e interromper a reação com 1 ml de 3,5DNS segundo o quadro abaixo: (agitar cada tubo após a adição das soluções).

TUBOS 1 2 3 4 5 6 B

Tempo

Tempo para a adição da invertase (0,1ml) Tempo inicial

0’

30’’