DIAGNÓSTICO MOLECULAR VIA PCR DE BRUCELOSE BOVINA ATRAVÉS DA DIFERENCIAÇÃO DA CEPA VACINAL (B19) OU CAMPO DE Brucella Abortus

Edson Wanderley da Silva1; Mariana Saragiotto da Silva-Alves2.

1. Aluno do Curso de Zootecnia da Faculdade Católica do Tocantins; e-mail: [e-mail] ; 2. Professora dos cursos de Agronomia e Zootecnia da Faculdade Católica do Tocantins; e-mail: [e-mail].

Resumo

A Brucelose trata-se de uma zoonose causada por uma bactéria pertencente ao gênero Brucella sp. Essa doença pode acarretar em queda na produção de leite e de carne decorrentes de abortos, nascimentos prematuros e esterilidade. Essa doença pode ser detectada através da análise de anticorpos no soro bovino, mas esse método indireto não apresenta sensibilidade absoluta. Sendo assim a técnica de PCR pode auxiliar no diagnóstico de Brucelose, pois é um método bastante sensível, possibilitando a detecção de animais positivos, sobretudo na fase inicial da infecção. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi testar a eficiência de dois métodos de conservação de amostras biológicas para análises de DNA. A partir dessa etapa será possível realizar a validação de primers específicos para identificação diferencial da presença de B. abortus proveniente da cepa vacinal B19 ou da cepa de campo em amostras coletadas de animais que foram abatidos em frigoríficos do estado do Tocantins. As amostras de tecido dos animais foram coletadas utilizando dois métodos de conservação, um em álcool absoluto e outra em freezer sem o uso de conservantes. Como resultado, ambas as formas de conservação apresentaram bons resultados quanto à qualidade do DNA, o que possibilita o uso desse DNA extraído para o diagnóstico molecular de brucelose bovina.

Palavras-chave: Brucelose bovina; Brucella abortus; PCR; conservação de amostras.

1. Introdução

A Brucelose trata-se de uma zoonose causada por uma bactéria pertencente ao gênero Brucella sp., sendo que, a bactéria da espécie Brucella abortus acomete preferencialmente bovinos, ovinos e canídeos. Os órgãos de predileção da bactéria são aqueles com maior disponibilidade de elementos necessários para o seu metabolismo, como o eritritol (álcool polihídrico de quatro carbonos), que está mais presente no útero gravídico, tecidos mamários e ósteoarticulares, além de órgãos do sistema reprodutor masculino (PAULIN, 2003). Essa doença é classificada como uma enfermidade transmissível e de grande importância do ponto de vista socioeconômico, pois pode acarretar em queda na produção de leite e de carne decorrentes de abortos, nascimentos prematuros e esterilidade (BRASIL, 2006). O estado do Tocantins possui alta relevância na produção de carne bovina pois contribui com aproximadamente 236 mil toneladas dessa produção nacional sendo 17 mil toneladas da produção exportada para países como Russia (BESSA, 2011).

Mas para manutenção da qualidade do produto produzido em nível estadual e nacional é necessária a prevenção da Brucelose em bovinos. Para o controle dessa zoonose de grande importância para a agropecuária, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), por meio do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (PNCEBT), tornou obrigatória a vacinação contra a brucelose bovina e bubalina em todo país. As vacinas mais conhecidas são B19 e a RB51. A B19 é atualmente a vacina mais difundida para a brucelose no país, sendo produzida com amostra viva de B. abortus estirpe B19. Sua aplicação deve ser feita em dose única nas fêmeas de 3 a 8 meses de vida.

Ainda de acordo com PNCEBT (2001), o diagnóstico para Brucelose é feito utilizando métodos indiretos através da detecção de anticorpos contra B. abortus em soro. Porém, autores como OLIVEIRA (2003) relatam que os testes sorológicos não apresentam sensibilidade absoluta, havendo necessidade de associação de várias técnicas em busca de melhores resultados na detecção de animais positivos, sobretudo na fase inicial da infecção e em infecções crônicas.

Já os métodos diretos são caracterizados pelo isolamento e identificação do agente etiológico através de técnicas de imunohistoquímica, além do método de detecção de genes específicos do patógeno, via reação em cadeia da DNA polimerase, do inglês, polymerase chain reaction (PCR). A reação em cadeia da polimerase (PCR) permite a detecção de um segmento específico de DNA por ampliação enzimática in vitro, o que facilita o diagnóstico direto de doenças infecciosas em virtude da identificação do ácido nucléico do agente, além de superar as limitações relacionadas ao isolamento por métodos tradicionais de cultura de microrganismos. Autores como SOLA (2011) relatam que o emprego da PCR na detecção do agente bacteriano apresenta enorme rapidez e sensibilidade, além da vantagem da detecção de pequenas quantidades de microrganismos em diferentes substratos, sem necessidade de estarem viáveis, como ocorre na cultura bacteriológica. Mas devido à alta similaridade genética entre espécies do gênero Brucella sp, BRICKER e HALLING (1994) descreveram um método de PCR que diferencia a maioria das espécies de Brucella baseado no elemento repetitivo IS 711. Em 2000, EWALT e BRICKER validaram a técnica para a diferenciação de Brucella abortus em cepa de campo e vacinal utilizando primers específicos para uma região que a cepa vacinal B19 possui uma deleção.

Tendo em vista a grande importância da brucelose para agropecuária brasileira com ênfase para a produção tocantinense, e ainda à alta eficiência da técnica de PCR para diagnóstico da mesma, o objetivo deste trabalho foi testar a eficiência de dois métodos de conservação de amostras biológicas para análises de DNA. A partir dessa etapa será possível realizar a validação de primers específicos para identificação diferencial da presença de B. abortus proveniente da cepa vacinal B19 ou da cepa de campo em amostras coletadas de animais que foram abatidos em frigoríficos do estado do Tocantins.

2. Material e Métodos

2.1 Amostras

A coleta das amostras foi efetuada imediatamente após o abate e foram mantidas em gelo durante a coleta e posteriormente acondicionadas em freezer. De cada animal, após coleta, as amostras foram divididas em 2 partes. Uma fração foi mantida em álcool absoluto e a outra parte foi mantida em gelo durante a coleta para posteriormente serem acondicionadas em freezer sem conservantes. Esse teste foi feito para a checagem da qualidade das amostras de DNA extraídas a partir dos dois diferentes métodos de conservação de amostras. A escolha dos tecidos baseou-se nos estudos realizados