Temperatura ótima

1. ESTUDO DA TEMPERATURA ÓTIMA E DE ESTABILIDADE DA ENZIMA Accelerzyme® CPG

A preparação enzimática da carboxipeptidase conhecida como Accelerzyme® CPG é derivada de culturas do microrganismo Aspergillus niger geneticamente modificado. (ESKIN, SAHIDI, 2013). No trabalho de Kilcawley et al (2013), a enzima foi analisada quanto ao seu potencial na maturação de queijo Cheddar. A enzima foi desenvolvida segundo o trabalho de Dijk et al. (2007) e os procedimentos de purificação e caracterização de acordo com o trabalho de Degan, Ribadeu- Dumas & Bredam (1992).

A importância do estudo da dependência da atividade enzimática em relação à temperatura reside no fato de que diferentes experimentos em diferentes temperaturas sob diversas condições experimentais (presença de inibidores, substratos análogos, diferentes pHs e forças iônicas etc) podem fornecer muitos dados sobre o mecanismo da catálise enzimática. Na prática sua importância pode ser vista na utilização de enzimas, a qual é importante utilizar uma temperatura na qual a atividade enzimática é apreciável, sem que haja desnaturação proteica (ISHII-IWAMOTO, BRACHT, 2003).

O objetivo de se estudar a Temperatura ótima de uma enzima é conhecer a condição que a enzima possui atividade máxima. Nesses estudos não foram feitos estudos que comprovasse a temperatura ótima para a atividade máxima da enzima em questão. Os experimentos realizados foram a produção, purificação e caracterização. O pH foi utilizado como parâmetro para avaliação da estabilidade.

Como não se sabe a temperatura ótima de atividade da Accelerzyme CPG, pegou-se como referência a temperatura a qual foi utilizada no trabalho de Kilcawley et al (2013), que foi de 8 ºC durante a maturação dos queijos. Para conhecer a temperatura ótima desta enzima sugere-se dissolver uma amostra da enzima em água ou em algum solvente orgânico, ambos em quantidades conhecidas. Adiciona-se também uma solução tampão de acetato de sódio com pH 4,5 (DEGAN, RIBADEU- DUMAS & BREDAM ,1992) para que mantenha-se constante e que não possa interferir na atividade enzimática, já que o parâmetro a ser medido é a temperatura. Após o preparo das amostras, submeter a amostra em temperaturas abaixo e acima de 8 ºC (5 ºC, 6 ºC, 7 ºC,8 ºC, 14 ºC, 20 ºC, 25 ºC e 35 ºC). Assim que a temperatura determinada for alcançada, retirar 1mL da amostra, adicionar solução colorimétrica DNS, e colocar em banho quente durante 5 minutos, e posteriormente resfriar em banho de gelo. Este procedimento tem o objetivo de desnaturar a enzima para que sua atividade seja medida pela quantidade de substrato gerado àquela temperatura estabelecida. Depois, adiciona-se água e a amostra é lida no espectrofotômetro para leitura com onda de 540 nm, para calcular a concentração de substrato formado.

Para o cálculo da temperatura de estabilidade da enzima, a qual a enzima possua um bom desempenho na formação de substrato, mas que não se utilize de sua capacidade máxima, a variável a ser fixada são as temperaturas e as amostras serão retiradas em função do tempo. Como exemplo, podemos fixar a temperatura de 8ºC e começarmos a medir a atividade enzimática a partir do ponto zero como tempo inicial T1 e posteriormente em tempos diferentes, como 5 min, 10 min, 15 min. Após verificar o tempo de atividade desta enzima, altera-se

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