Uso de um esfigmomanômetro para determinar as concentrações

RESUMO

As proteínas, além de constituírem o componente celular mais abundante, são as moléculas mais diversificadas quanto à forma e à função. As funções que desempenham são estruturais e dinâmicas, e participam de quase todos os processos biológicos, já que incluem as enzimas. Para quantificar as proteínas e as absorbâncias são utilizados dois métodos: o Método de Lowry e a Espectrofometria, em que pode-se ser construída uma curva padrão a partir das amostras realizadas. Este experimento teve o propósito de validar o Método de Lowry, com a utilização da proteína do leite (integral e desnatado). A espectrofometria demonstrou-se eficaz também, além de ser de fácil manuseio. Os métodos utilizados foram desenvolvidos e validados.

1. INTRODUÇÃO

As proteínas, além de constituírem o componente celular mais abundante, são as moléculas mais diversificadas quanto à forma e à função. As funções que desempenham são estruturais e dinâmicas (são componentes do citoesqueleto e de estruturas de sustentação – como exemplo o colágeno – e participam de quase todos os processos biológicos, já que incluem as enzimas, que catalisam (aceleram) as milhares de reações químicas que ocorrem nos organismos; outra função dinâmica das proteínas é o transporte de moléculas)(MARZZOCO e TORRES, 2011).

Contudo para quantificar essas proteínas são utilizados vários métodos, dentre eles o Método de Lowry, que consiste em numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre (II), e produz um composto com absorção máxima em 750 nm.

A principal vantagem deste método é a sua alta sensibilidade, por isso vem sendo muito utilizado para determinar a concentração das proteínas em diversos meios, mas este possui mais vantagens, tais como: melhor exatidão, menor consumo de amostra, e também é menos suscetível a alguns tipos de interferentes. Porém o método de Lowry também possui algumas desvantagens, como por exemplo: estar sujeito a muitos interferentes, apresentar longo tempo de análise e possuir absortividade específica altamente variável para diferentes proteínas (LOWRY, 1951).

Entretanto para contabilizar as leituras das absorbâncias adquiridas nos experimentos com proteínas, é utilizada a espectrofometria, que baseia-se em permitir a identificação e quantificação das substâncias com base em seu espectro. A quantificação é realizada através da relação entre a quantidade de luz absorvida e a concentração da substância; em que a absorção de luz aumenta conforme aumenta-se a concentração da solução por ela atravessada, e conforme aumenta-se a distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra.

O método de determinação da concentração de um soluto em uma amostra através da espectrofometria é feito por meio da comparação da absorbância da amostra com uma solução padrão (na qual já é conhecida a concentração do soluto); os padrões de referência contidos na solução padrão são obtidos pela diluição da solução padrão na proporção desejada para a obtenção das concentrações desejadas.

Com os valores de concentração e de absorbância conhecidos, pode-se traçar um gráfico conhecido como “curva padrão”; cuja reta indica a proporcionalidade entre o aumento da concentração e da absorbância, e a porção linear correspondente ao limite de sensibilidade do método espectrofotométrico para o soluto em questão.

1.1 Objetivos

Os objetivos desta aula prática foram utilizar a esctrofometria para fazer determinar as concentrações, elaborar uma curva padrão de proteínas através do método de Lowry e determinar a concentração de proteínas no leite integral e no leite desnatado.

2.MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Materiais

-Micro-tubos

-Leite integral (50μL)

-Leite desnatado (50μL)

-Água destilada

-Solução padrão de Albumina (0,4mg/ml)

-Mistura reativa

-Reativo de Folin

-Agitador para tubos

-Espectrofotômetro

2.2 Métodos

2.2.1 Diluição do leite em micro-tubos:

Primeiramente identificou-se dois micro-tubos, um como leite integral e outro como leite desnatado e posteriormente dilui-se suas amostras (respectivamente) em água destilada na proporção de 1:20, ou seja, 50μL de leite integral + 950μL de água destilada (em um micro-tubo) e 50μL de leite desnatado + 950μL de água destilada (em outro micro-tubo); e agitou-se até a solução ficar homogênea.

2.2.2 Preparação dos tubos de ensaio para a curva padrão:

Enumerou-se os tubos de ensaio da curva padrão de 1 a 5, e em outro tubo escreveu-se branco. Assim como foram escritas em triplicatas: leite integral diluído, e em outras triplicatas: leite desnatado diluído.

Para a curva padrão, as soluções nos tubos foram produzidas da seguinte maneira:

-No tubo branco não colocou-se a solução padrão de albumina(0,4mg/mL), mas colocou-se 500μL de água destilada;

-No tubo1, colocou-se 100μL da solução padrão de albumina(0,4mg/mL) e 400μL de água destilada;

-No tubo 2, colocou-se 200μL da solução padrão de albumina(0,4mg/mL) e 300μL de água destilada;

-No tubo 3, colocou-se 300μL da solução padrão de albumina(0,4mg/mL) e 200μL de água destilada;

-No tubo 4, colocou-se 400μL da solução padrão de albumina(0,4mg/mL) e 100μL de água destilada;

-No tubo 5, colocou-se 500μL da solução padrão de albumina(0,4mg/mL) mas não colocou-se água destilada.

Já para as triplicatas, as soluções nos tubos foram produzidas do seguinte modo:

-Nas triplicatas do leite integral: adicionou-se 50μL de leite integral diluído 20 vezes e 450μL de água destilada, em cada um dos três tubos;

-Nas triplicatas do leite