DNA

Atualmente, uma série de novas técnicas permite ao pesquisador a análise detalhada da estrutura molecular do DNA e, por consequência, do material genético de um ser vivo. Esta análise permite, por sua vez, o isolamento e a amplificação de um segmento de DNA, o seu sequenciamento, identificação e manipulação. O Projeto Genoma, por exemplo, pretende, através destas técnicas, identificar toda a sequência de cerca de 3 bilhões de pares de bases do genoma humano - 50.000 a 100.000 genes!! Esta abordagem permitirá a identificação de genes relacionados a doenças genéticas específicas, e abre a possibilidade de diagnóstico e até tratamento estas doenças a nível molecular.

Sequenciamento do DNA: Duas técnicas, surgidas no final dos anos 70, são empregadas para o sequenciamento de fragmentos de nucleotídeos:

Método Químico ou de Maxam-Gilbert Método Enzimático ou de Singer Em ambos os casos, é possível se definir com precisão a sequência exata de nucleotídeos de um segmento de DNA

Amplificação de um Segmento de DNA: O enorme tamanho e a imensa variabilidade da molécula do DNA são os principais obstáculos ao isolamento e sequenciamento de genes. Assim, técnicas especiais são necessárias para a seleção e amplificação de partes da molécula do DNA, gerando fragmentos menores e mais facilmente analisáveis. São duas as metodologias empregadas atualmente:

A Reação em Cadeia da Polimerase - "Polimerase Chain Reaction", ou PCR. A Clonagem de Genes

"Polimerase Chain Reaction" - PCR

Este método - mais recente - de isolamento e amplificação de um segmento de DNA - envolve a produção "in vitro" de milhões de cópias do segmento em estudo. O processo exige a utilização de "primers" que isolam o segmento a ser amplificado, da enzima DNA Polimerase, e ocorre em 3 etapas:

A desnaturação da dupla fita do DNA, em alta temperatura - 90oC O pareamento dos "primers", a baixa temperatura - 37o C A duplicação do segmento isolado através da reação da DNA polimerase. O processo é cíclico e pode ser repetido "n" vezes, dependendo do grau de amplificação que se deseja. O "primer" pode ser sintetizado quimicamente, desde que se conheça a seqüência a ser amplificada e a partir desta, e é sempre adicionado em excesso ao meio de reação. Se o segmento de DNA a ser amplificado não é conhecido, ele pode ser clonado a um vetor cuja seqüência de DNA adjacente ao recombinante seja conhecida.A DNA Polimerase utilizada é termoestável, e isolada do microorganismo Termus aquaticus (Taq Polimerase). A tecnologia da PCR pode ser empregada nas análises clínicas como um poderoso instrumento de diagnóstico de viroses e infecções bacterianas, como a AIDS e a tuberculose, por exemplo, com enorme ganho em sensibilidade.

Clonagem de Genes É um método mais complexo de isolamento e amplificação de DNA que a PCR, mas muito útil em certas situações. Envolve a utilização de endonucleases de restrição, a criação de mapas de restrição e a utilização de vetores para a recombinação e clonagem do gene em estudo. Em etapas:

As Endonucleases de Restrição fazem a clivagem da molécula do DNA em seqüências específicas da molécula, geralmente palindrômicas.

Ex:

GAATTC

CTTAAG

A Criação do DNA Recombinante envolve a união de um fragmento de DNA a uma molécula maior, utilizando-se uma endonuclease de restrição e a DNA ligase. A clivagem do DNA com a mesma enzima de restrição cria extremidades complementares adesivas que são unidas pela ação da DNA ligase. Desta forma, um fragmento de DNA pode ser inserido em uma molécula maior, que passa a ser recombinante. Assim, um determinado gene do genoma humano pode ser inserido no genoma de uma bactéria, por exemplo, e lá ser amplificado ou mesmo transcrito várias vezes.

Os Vetores: Um vetor é uma molécula de DNA à qual o fragmento de DNA a ser clonado está ligado. Os principais vetores utilizados são plasmídeos, e vírus de animais. Os plasmídeos são os mais utilizados para a clonagem de pequenos fragmentos de DNA; são geralmente obtidos a partir de células bacterianas, facilmente reintroduzidos nestas células e possuem capacidade autônoma de replicação. Um exemplo amplamente utilizado de plasmídeo é o pBR322, que possui os genes de resistência à tetraciclina e à ampicilina. Alguns tipos de vírus, como o bacteriófago l , são utilizados na clonagem de fragmentos maiores de DNA. Os Cosmídeos são estruturas híbridas que possuem características do bacteriófago associadas à do plasmídeo pBR322, e são utilizadas para a clonagem dos maiores segmentos de DNA.

Bibliotecas de DNA: Uma biblioteca de DNA é uma coleção de fragmentos de DNA obtidos a partir da ação das endonucleases de restrição, ligados aos vetores apropriados e clonados. Quando a biblioteca inclui a totalidade do genoma de uma célula ou organismo, ela é dita "Biblioteca Genômica". Quando a biblioteca inclui apenas moldes de cDNA, obtidos por ação de uma transcriptase reversa, esta biblioteca é dita "Biblioteca de DNA Complementar". A detecção de um determinado segmento de DNA em uma biblioteca genômica é feita com a utilização de sondas de DNA.

Sondas: As sondas de DNA são seqüências de fita única de DNA que hibridizam - pareiam - com a seqüência de interesse, destacando-as do restante da biblioteca. Estas sondas podem ser marcadas com um isótopo radioativo, um anticorpo, uma substância fluorescente ou outro método de detecção. A utilização em conjunto das sondas e de enzimas de restrição permitiram o desenvolvimento de técnicas de detecção de DNA muito precisas, como o "Southern Blot". No "Southern Blot", um determinado gene pode ser identificado entre milhões de fragmentos por separação eletroforética em gel com posterior identificação dos fragmentos através de sondas específicas. Variações deste método permitem hoje a identificação de fragmentos de RNA - Northern Blot - e de proteínas - Western Blot, este último utilizando um anticorpo no lugar da sonda.

São enormes e promissoras as aplicações desta tecnologia:

1 - Na identificação e tratamento de doenças condicionadas geneticamente;

2 - No diagnóstico muito sensível de doenças infecciosas;

3 - No diagnóstico pré-natal;

4 - Na manipulação terapêutica de genes;