Métodos e características de identificação

Aula Prática n.º 4

Métodos de identificação e caracterização: principais provas bioquímicas; sistemas

automatizados.

Outros métodos de identificação e caracterização de isolados: métodos imunológicos e de biologia molecular.

CULTURA DE MICRORGANISMOS - PROVAS BIOQUÍMICAS

⦁ Conhecer princípios e procedimentos de diversas provas bioquímicas usadas na identificação de microrganismos.

⦁ Analisar as provas bioquímicas realizadas (leituras directas e indirectas).

TEXTO DE APOIO:

⦁ Provas fermentativas

⦁ Prova ONPG

⦁ Prova de Kligler (agar Kligler) ou agar Triple Sugar Iron (TSI)

⦁ Hidrólise do amido

⦁ Prova do sulfureto de hidrogénio (H2S)

⦁ Hidrólise da gelatina

⦁ Hidrólise da caseína

⦁ Prova IMViC

⦁ Prova do indol

⦁ Prova do vermelho de metilo

⦁ Prova de Voges-Proskauer

⦁ Prova da utilização do citrato

⦁ Descarboxilação da lisina

⦁ Desaminação da fenilalanina

⦁ Prova da redução dos nitratos

⦁ Prova da urease

⦁ Prova das oxídases

⦁ Prova da catálase

⦁ Prova da coagulase

ACTIVIDADES BIOQUÍMICAS DOS MICRORGANISMOS

Os microrganismos efectuam as suas variadas actividades bioquímicas utilizando nutrientes obtidos a partir do ambiente que os rodeia. Essas reacções bioquímicas que ocorrem dentro ou fora dos microrganismos são catalisadas por enzimas.

No laboratório, é possível demonstrar algumas das actividades bioquímicas através da observação da capacidade dos microrganismos usarem enzimas para degradar hidratos de carbono, lipidos, proteínas e aminoácidos. Geralmente, a metabolização destas moléculas orgânicas origina produtos finais cuja detecção pode ajudar na caracterização e identificação dos microrganismos.

Hidratos de carbono

Provas fermentativas

As fermentações são reacções bioquímicas produtoras de energia em que moléculas orgânicas servem como aceitadores e dadores de electrões. A capacidade dos microrganismos fermentarem hidratos de carbono e os tipos de produtos formados são úteis na sua identificação. Um determinado hidrato de carbono pode ser fermentado originando diferentes produtos finais consoante o tipo de microrganismo envolvido. Estes produtos finais (álcoois, ácidos, gases ou outras moléculas orgânicas) são característicos dos microrganismos e podem ser usados para os identificar.

Na fermentação, substratos como hidratos de carbono e álcoois sofrem uma desassimilação anaeróbia, podendo ocorrer produção de compostos orgânicos ácidos que podem ser acompanhados por gases, como hidrogénio ou CO2. Os microrganismos anaeróbios facultativos são geralmente os chamados fermentadores de hidratos de carbono.

A degradação fermentativa faz-se habitualmente num meio líquido que contém nutrientes para suporte do crescimento do microrganismo, o hidrato de carbono específico que serve de substrato para determinar a sua capacidade fermentativa e um indicador de pH (ex. vermelho de fenol ou púrpura de bromocresol). Nesse caldo de fermentação existe também um tubo de Durham (pequeno tubo colocado em posição invertida dentro do meio de cultura líquido) que permite detectar a produção de gás.

Após incubação, a libertação de compostos ácidos, resultantes da fermentação do hidrato de carbono, faz descer o pH o que conduz à mudança da cor original do meio, pois está presente um indicador de pH (reacção positiva). Em alguns casos, a produção de ácido é acompanhada pela produção de gás (CO2) que é visível, pois o meio líquido que estava dentro do tubo de Durham é substituído por gás em forma de bolhas. Na fermentação alcoólica ocorre produção de gás no tubo de Durham, mas o meio de cultura mantém a cor inicial.

As culturas que não são capazes de fermentar o hidrato de carbono não conduzem à mudança de cor do meio nem apresentam produção de gás (reacção negativa). O facto de não ter havido fermentação do hidrato de carbono não significa ausência de crescimento, pois o microrganismo pode usar outros nutrientes do meio (ex. peptonas) como fonte de energia.

Todas as culturas devem ser observadas às 24 a 48 h, uma vez que uma incubação prolongada pode mascarar a produção de ácido, pois ocorre produção de substâncias alcalinas resultantes da acção enzimática sobre outros substratos.

São exemplos de provas para identificação de microrganismos as fermentações da glicose, lactose, sacarose, manose, inositol, sorbitol, arabinose, etc.

Actividade da b-galactosidase (Prova ONPG)

Alguns microrganismos, como a Escherichia coli, podem usar a lactose como a sua única fonte de carbono. As enzimas essenciais ao metabolismo deste hidrato de carbono são a b-galactosidase que hidrolisa a lactose, a galactose e glicose e uma permease que transporta a lactose através da membrana celular, tornando-a disponível para a

b-galactosidase intracelular. Os verdadeiros não fermentadores da lactose não possuem a b-galactosidase.

Nesta prova, em vez de lactose, o substrato natural desta enzima, utiliza-se o substrato artificial ONPG (o-nitrofenil-b-D-galactopiranosídeo). A b-galactosidase catalisa a hidrólise do ONPG formando-se galactose e o-nitrofenol. O ONPG é incolor, mas após hidrólise origina o-nitrofenol, que é amarelo numa solução alcalina. Num tubo de ensaio contendo água destilada inocula-se a bactéria, após esta ter sido semeada num meio com lactose, e um disco de ONPG e incuba-se a 37º C. Após 20 minutos a 1 hora verifica-se se ocorreu mudança de cor de incolor para amarelo, caso contrário a incubação