Estudo da Especificidade das Enzimas Quanto ao Substrato

Universidade Estadual de Campinas[pic 1][pic 2]

Faculdade de Engenharia de Alimentos

TA 514 – Bioquímica de Alimentos

Estudo da Especificidade das Enzimas Quanto ao Substrato

GRUPO IX –

GIOVANNA PANSONATO      146260

1. Introdução

As enzimas apresentam uma especificidade muito alta par ao tipo de reação que catalisam. Mas nem sempre elas apresentam o mesmo grau de especificidade para o substrato que transforma. Por exemplo, enquanto a succinato desidrogenase sempre catalisa uma realão de oxirredução e age invariavelmente sobre o ácido succínico – seu susbstrato- a enzima álcool desidrogenase (ADH) sempre catalisa reações de oxirredução, mas tem como substrato diferentes álcoois: desde metanol até butanol. Essa classe de enzimas, embora apresente uma ampla especificidade, são mais ativas na presença de um substrato em particular. No caso da ADH, o etanol é o substrato preferido.

Assim como existem enzimas que apresentam especificidade para diversos substratos, existe substrato que sofre a ação de diferentes enzimas e são transformados no mesmo produto. Os membros individuais de um grupo de enzimas com caracterpisticas semelhantes são chamadas de isoenzimas. A composição dessas isoenzimas faz  com que todas elas catalisem a mesma reação química, embora apresentem diferentes graus de eficiência.

As enzimas podem apresentar diferentes graus variáveis de especificidade.

 Baixa especificidade: A enzima não discrimina os substratos, mas exibe especificidade somente em relação à ligação a ser rompida.

Especificidade de grupo: A enzima é específica para uma ligação particular adjacente a um grupo específico. Por exemplo, a tripsina é específica para ligações peptídicas do lado de grupos carboxilas da arginina e lisina.

Especificidade absoluta: A enzima  atua somente em um substrato ou seja catalisa somente uma reação.

Especificidade estereoquímica: Muitas enzimas mostram especificidade para isômeros ópticos ou isômeros geométricos específicos. E quase sempre atuam sobre uma das formas de isômero.

1. Objetivos

Verificar a especificidade das enzimas protease, α-amilase, lactase ou β-galactosidase e invertase ou β-frutofuranosidase quanto ao substrato.

1. Materiais e métodos

1. Materiais

- 3 Tubos com 5 mL de solução 5% de gelatina em tampão fosfato 0,05M pH 6,0 ( Item I )

- Solução de papaína 6 mg/mL ( Item 1)

- 3 Tubos com 2 g de amido de batata ( Item I )

- Solução de α-amilase bacteriana 10μL/mL ( Item I )

- Tampão Fosfato 0,05Mol/L pH 6,0

- Solução 1% Amido em Tampão Fosfato 0,1 Mol/L pH 6,0

- Solução 1% Sacarose em Tampão Acetato 0,1 Mol/L pH 5,0

- Solução 0,05 % Lactose em Tampão Fosfato 0,1 Mol/L pH 6,5

- Solução de Lactase comercial 2,5 mL/50 mL

- Solução de β frutofuranosidase ou invertase comercial 0,12 mg/100 mL

- Solução de α-amilase bacteriana Grupos pares:   0,1 mL / 250 mL

                                                          Grupos impar:   0,1 mL / 500 mL

- Reagente SN I

- Reagente SN II

3.2) Métodos

I- Especificidade da α-amilase e protease

I-A) Teste de hidrólise de gelatina

• 3 tubos foram numerados e identificados (G-1, G-2, G-3), contendo 5mL de solução 5% de gelatina em Tampão Fosfato 0,05 Mol/L pH 6,0.

• Foi pipetado 1 mL de solução 2 mg/mL de papaína no tubo G-1.

• Foi pipetado 1 mL de solução 10μL/mL de α-amilase bacteriana no tubo G-2.

• No tubo G-3 foi pipetado 1 mL de  água destilada.

• As misturas foram homogeneizadas e incubadas em banho-maria a 50°C por 30 minutos.

• Depois da incubação, os tubos foram colocados em banho de gelo por 10 minutos e foi verificado em quais tubos ocorreu gelificação ou hidrolise da gelatina.

IB- Teste de hidrólise de amido

•Foi adicionado 10 mL de Tampão Fosfato 0,05Mol/L pH 6,0 nos 3 tubos de ensaio contendo 2 g de amido de batata e numerados como AM-1, AM-2 e AM-3.

• Foi pipetado 1 mL de solução 2mg/mL de papaína no tubo  AM-1.

• Foi pipetado 1 mL de solução 10μL/mL de α-amilase bacteriana no tubo  AM-2.

• Foi pipetado 1 mL de  água destilada no tubo controle AM-3.

•As misturas foram homogeneizadas e incubadas em banho-maria a 90°C.

• Os tubos foram resfriados em água corrente e foi observado em quais tubos ocorreu gelificação ou hidrolise do amido.

II - Especificidade das enzimas β-galactosidase, invertase e α - amilase bacteriana quanto ao substrato.

II A- Determinação de açúcares formados na hidrólise de lactose, sacarose e amido, respectivamente, pelas enzimas β-galactosidase, β-frutofuranosidase e α-amilase pelo método colorimétrico de Somogyi –Nelson

• As misturas de reação foram prepadas em tubos de ensaio numerados como descrito na tabela a seguir:

Tabela 1-Estudo da especificidade da β-galactosidase, β-frutofuranosidase e α-amilase
	Tubos
Soluções	L1	L2	S1	S2	A1	A2
Solução 0,05% de Lactose em Tampão Fosfato 0,1 Mol/L  pH 6,5	2 mL	2 mL	-	-	-	-
Solução 1% de Sacarose em Tampão Acetato 0,1 Mol/L pH 5,0	-	-	2 mL	2 mL	-	-
Solução 1% Amido em Tampão Fosfato 0,1 Mol/L pH 6,0	-	-	-	-	2 mL	2 mL
Enzima β-galactosidase ou lactase (2,5 mL / 50 mL)	-	1 mL	-	-	-	-
Enzima β-frutofuranosidase ou Invertase (0,12 mg / 100 mL)	-	-	-	1 mL	-	-
Enzima  α-amilase bacteriana Grupos pares  ( 0,1 mL/250 mL ) Grupos impar ( 0,1 mL/500 mL )	-	-	-	-	-	1 mL
H20 destilada	1 mL	-	1 mL	-	1 mL	-
	Incubar a 40ºC	Incubar  a 50ºC	Incubar  a 60ºC

• Os tubos L1 e L2 foram encubados em banho maria durante 20 minutos a 40oC.