A Espectrofotometria

Desenvolvimento de extração por ponto nuvem e método de micro-placas à base de espectrofotometria para a determinação de nitrito na urina humana e sangue.

Abstrato:

        É um novo Método para a determinação sensível de quantidades vestigiais de nitrito na urina e sangue humano que combina a extração por ponto nuvem (CPE) e o ensaio de microplaca. Este método baseia-se na reação de Griess e o produto é extraído para surfactante não iônico Triton-X114 utilizando o processo de CPE. Neste estudo, descoloriu a urina e o sangue para ultrapassar a matriz e aumentar a sensibilidade de detecção do nitrito. Várias amostras podem ser detectadas simultaneamente, por causa da técnica de microplacas de 96 poços. Nas condições ótimas, foi obitida uma curva de calibração linear na gama de 10-400 ng mL – 1 de nitrito com limite de 2,5 ng mL – 1. O desvio padrão relativo foi de 100 ng ml – 1 de nitrito foi 2,80%. O método oi aplicado com sucesso na determinação de nitrito nas amostras de urina e de sangue com recuperação de 92,6 – 101,2%.

Introdução:

        O óxido nítrico (ON) é um radical livre altamente reativo e uma molécula de sinalização celular importante que regula diversos processos fisiológicos no corpo humano, incluindo a modulação dos vasos sanguíneos, a comunicação neural e a resposta imunitária. O óxido nítrico pode ser diretamente medido na circulação humana após estimulação, no entanto, o ON endógeno na porção basal não foi confiavelmente quantificado na urina e no sangue, até agora. Os estudos de ON são limitados pela sua curta meia vida, que é 0,05-1,8 ms nos fluidos biologicos. No plasma ou em outros fluidos fisologicos, o ON é oxidado quase completamente para nitrito e nitrato, onde permanecem estaveis por varias horas. Nitrito e nitarto são metabolitos estaveis de ON, ambos presente no sangue e na urina, e acessiveis para analise. A determinação quantitativa da concentração de nitrito e nitrato nos fluidos biologicos, plasma, soro e urina, é o metodo mais eficaz para ter acesso a sintese de ON in vivo. Estudos in vivo em seres humanos e mamíferos indicam que a circulação de nitrito em vez de nitrato reflete na síntese de óxido nítrico dependente do endotélio em seres humanos e mamíferos. O nitrito esta em quantidades relativamente baixas em comparação com o nitrato no plasma humano e na urina, e sua concentração está abaixo do limite de detecção. Além disso, uma grande quantidade do nitrato dos seres humanos e animais de laboratório ( camundongo, rato, coelho e porquinho da índia) vem apartir das fontes alimentares. Isto significa que a concentração de nitrito descreve melhor a formação de óxido nítrico do que faz o nitrato.

        Muitos métodos publicados são falhos para detectar nitrito em fluidos biológicos, porque o nitrito em fluidos biológicos está em um nível muito baixo e é muito sensível ao substrato.

        Espectrofotometria é provavelmente o método mais comum usado para medição de nitrito usando reação de colorimétrico. Embora a fraqueza desse método (e todos os outros métodos que dependem da detecção colorimétrica) é a interferência de outros cromóforos da amostra. Com base em considerações de simplicidade, rapidez, estabilidade de cor, adesão à lei da cerveja e sensibilidade, que propõe o processamento de descolorização para superar a cor de interferência a partir da amostra da matriz. Além disso, o rastreamento de nitrito na urina e no sangue é enriquecido pelo agente tensioativo Triton-X114 usando a técnica de CPE. A extração por ponto nuvem (CPE) é uma técnica de extração baseada no fenômeno de turvação dos surfactantes, e foi primeiramente introduzido por Watanabe e Tanaka por íons de metal pré-concentrados a partir de amostras aquosas. Em certa temperatura, a solução aquosa de um surfactante não iônico torna-se turva. Sob o impacto de uma força centrifuga, a solução é separada em duas fases. O pequeno volume da fase rica em surfactante obtida usando a metodologia do ponto nuvem, permite projetar uma estratégia de extração apresentando baixo custo, boa eficiência na extração e menor toxicidade. Além disso, Triton-X114 que não apresenta um elevado fundo de absorção na região visível interfere com a determinação dos analitos alvo.

        A outra inovação do presente documento é a implementação de um conjunto de procedimentos analíticos em uma placa de micro titulação, para ter, assim, vantagem das grandes possibilidades oferecidas pelo ensaio em placas de micro titulação, a saber (1) o pequeno volume da fase rica em tensioativo obtido por meio da metodologia de ponto nuvem não devem ser diluídas; (2) possibilidades  de automação, rápida preparação de micro placas e análise de multi-amostras; (3) diminuição do consumo de materiais de teste e reagentes; (4) valor da absorção foi gravado pelo leitor da micro placa e diretamente armazenado no computador, e o erro pode ser reduzido a partir de diferentes experimentos. Apesar de reconhecer suas vantagens, o ensaio em placas de micro titulação tem sido raramente aplicado nas análises químicas, e podemos razoavelmente assumir a capacidade para seletivamente melhorar as propriedades de detecção de um dado tecido para que possa ter uma utilidade clínica ampla. Portanto, ele pode ser um instrumento valioso em estudos esperimentais e clinicos para determinar a fisiologica e fisiopatologica relevancia do óxido nitrico.

Experimentação:

Instrumentação

- Espectrofotômetro UV-vis modelo Tu-1810

- Leitor de microplaca de 96 poços

- 4 Pedaços de filtro (405, 450, 490, 630 nm)

- Banho d’água

- Agitador de vórtice

- Maquina centrifuga

Reagentes

- 200 ug/mL de nitrito dissolvendo 300mg de nitrito de sódio

- Diluição apropriada das soluções

- Solução de 10mg/mL de ácido sulfanilico dissolvendo 100mg de 1 – niftalina em 100mL de mentanol (50%)

- Triton X-114 (10%) diluído em 11,1 mL de Triton X-114 (90%) em um balão volumétrico de 100 mL  

OBS: Todos os produtos químicos utilizados eram de grau analítico e dupla agua destilada foi utilizada em todos.

Preparação de amostra de urina e sangue:   

Amostra de sangue total

As amostras de sangue total (5mL) foram retiradas de 10 voluntários da China. O plasma da camada superior foi transferido para um novo tubo, as amostras foram centrifugadas a 2000 rpm por 10 min. O plasma foi tanto utilizado para a análise imediata de nitrito ou armazenados a – 20 ºC até a análise. A proteína precipitante e o descolorante de 400 uL de NaOH (2,0 M) e 0,4 g de ZnSO4 foram adicionados num tubo de centrífuga de 10 mL com 2 ml de plasma. A mistura foi misturada no vórtice por 30 s, e depositados por centrifugação á 5000 rpm por 10 min. O sobrenadante límpido e incolor foi então transferido para um novo tubo, e 200 uL da solução de ácido sulfanílico (10 mg mL-1) e 200uL de solução de 1-naftilamina (1 mg mL-1) foi adicionada. A solução foi misturada completamente e diluída até ao volume de 5 ml com água destilada para análise posterior de acordo com o procedimento de CPE.  

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