Extração de DNA Total Todo ser vivo possui DNA (Ácido Desoxirribonucléico)

1. INTRODUÇÃO

Extração de DNA Total

 Todo ser vivo possui DNA (Ácido Desoxirribonucléico).

 Ele é um composto muito importante, pois contém toda a informação necessária para controlar e organizar as funções do organismo.

 Segundo Alberts (2010) “em uma célula eucariótica quase todo o DNA está contido em um núcleo que ocupa cerca de 10% do volume total da célula. O núcleo é delimitado por um envelope nuclear, e armazena e protege o DNA. Nos procariotos o DNA é circular e está solto dentro da célula".

 A extração de DNA é o primeiro passo para utilizá-lo em técnicas moleculares. Assim sendo, a qualidade e integridade do DNA são fundamentais para o sucesso nas etapas posteriores. Existem diferentes protocolos de extração de DNA que variam em função da espécie e do tecido a ser utilizado. A maneira de coletar e acondicionar o tecido, assim como o estado do mesmo é fundamental para o sucesso da extração. Um dos aspectos importantes é que a quantidade de DNA necessária varia em função da técnica molecular a ser utilizada. No caso de uma reação de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), por exemplo, são necessários somente alguns nanogramas de DNA, e para análise de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) são necessárias quantidades de DNA na ordem de microgramas.

 Após a extração, torna-se necessário quantificar o DNA para verificar a quantidade e a ocorrência de degradação no mesmo. Entre as técnicas disponíveis para estimar a concentração de DNA, as mais utilizadas são a leitura em espectrofotômetro e a análise comparativa em gel de agarose corado com brometo de etídio.

 A eletroforese foi inicialmente proposta por Arne Teselius (1937) como técnica empregada para visualização de proteínas de acordo com as diferenças de comprimento dos fragmentos de aminoácidos e cargas elétricas. A simplicidade e rapidez da técnica impulsionaram seu aprimoramento e uso, atualmente, para separar e purificar fragmentos de DNA.

Nesse trabalho apresentaremos os procedimentos para Extração total de DNA e o processo de quantificação ou seja a concentração de DNA extraído utilizando a técnica   de análise da eletroforese .

2. OBJETIVO

Esse relatório tem como intuito descrever o experimento feito na aula prática de Biotecnologia aplicada a Engenharia de Alimentos no laboratório, supervisionado e dirigido pela professora Antônia Queiroz lima de Souza em que as técnicas de extração de DNA e eletroforese foram exemplificadas, e através do método extração de DNA ou RNA purificado determinar a concentração de DNA extraído para estudos.

No processo que utilizemos para a extração de DNA tem quatro etapas básicas, presentes em qualquer protocolo de extração:

1. Lise de membranas lipídicas;
2. Lavagem do DNA (purificação)
3. Precipitação do DNA;
4. Reidratação do DNA:

 Eletroforese

 A eletroforese pode ser conduzida em solução com gradiente de densidade ou em diferentes meios-suportes, tais como papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros. O suporte deve ser química e fisicamente inerte, de modo a não interferir na mobilidade das moléculas. No caso de eletroforese em géis, como poliacrilamida e agarose, a migração das moléculas é profundamente influenciada pelas malhas porosas. A porosidade do gel determina o poder de resolução das bandas, sendo este geralmente decorrente do grau de polimerização entre os monômeros. Géis de poliacrilamida são frequentemente usados para análises de alta resolução (sequenciamento de DNA/RNA) em análises protéicas e isoenzimáticas que requeiram maio definição das bandas. Géis de agarose também são amplamente usados na separação de DNA/RNA, especialmente para fragmentos maiores.

 A eletroforese em gel de agarose é o método padrão usado para separar, identificar, analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é capaz de separar misturas de fragmentos de DNA que não podem ser separados por outros meios, tais como centrifugação com densidade de gradiente ou por velocidade de sedimentação. A localização do DNA no gel pode ser determinada diretamente. Concentrações de até 1ng de DNA podem ser visualizadas por exame direto do gel na luz ultravioleta.

 Esse relatório tem como intuito descrever o experimento feito na aula prática de genética realizada no laboratório de bioquímica com os alunos do segundo período de Medicina da UFT, supervisionado e dirigido pela professora e doutora Jaqueline das Dores Dias, em que as técnicas de extração de DNA e eletroforese foram exemplificadas.