ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE DEZ LOCOS MICROS SATÉLITES PARA ESPÉCIES DE ÁRVORES AMEAÇADAS LUEHEA DIVARICATA MARTUS (MALVACEAE) E TRANSFERABILIDADE

ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE DEZ LOCOS MICROSSATÉLITES PARA ESPÉCIES DE ÁRVORES AMEAÇADAS LUEHEA DIVARICATA MARTUS (MALVACEAE) E TRANSFERABILIDADE

André Ricardo Oliveira Conson (PIBIC/CNPq-UEL), Eduardo Augusto Ruas (CAPES), Bruno Fernandes Costa (PIBIC/CNPq-UEL), Luana Alves Rodrigues (CAPES), Claudete de Fátima Ruas (Co-Orientadora),

Paulo Maurício Ruas(Orientador), e-mail:ruas@sercomtel.com.br

Universidade Estadual de Londrina/Centro de Ciências Biológicas/Departamento de Biologia Geral – Londrina-PR

Palavras-chave: primers microssatélites, estrutura populacional, diversidade genética, Luehea divaricata. 

Resumo

Foram isolados e caracterizados dez pares de primers microssatélites de Luehea divaricata, uma espécie arbórea ameaçada. Foram detectados 45 alelos em uma amostragem de 42 indivíduos. O conteúdo informativo polimórfico médio foi de 0,54 e os valores de heterozigosidade observada e esperada, variaram de 0 a 0,92 e 0,19 para 0,82, respectivamente. Quatro locos mostraram desvio significativo a partir do equilíbrio de Hardy-Weinberg(P ≤ 0,001) e 24 locos mostraram desequilíbrio de ligação significativo (P ≤ 0,01). Os primers foram testados para a amplificação em nove espécies da família MALVACEAE.

Introdução

A bacia do rio Tibagi percorre grande parte do estado do Paraná, Brasil. Para facilitar os estudos a bacia do rio Tibagi, divide-se em alto, médio e baixo Tibagi, sendo que na região do baixo Tibagi a vegetação sofrera um processo intenso de fragmentação. Dentre as espécies vegetais com área de distribuição que abrangem tanto o alto, médio e baixo Tibagi está Luehea divaricata.

Luehea divaricata Martus et Zuccarini (MALVACEAE), popularmente conhecida como açoita-cavalo é uma espécie arbórea, com até 30m, pioneira (LORENZI, 2002), ameaçada, esta é frequentemente utilizada em programas de reflorestamento de florestas ciliares tropicais no Brasil. A madeira é empregada na confecção de móveis, construção civil, molduras, rodapés, guarnições. Sua casca é usada na medicina popular como antiinflamatório e antireumático (BIGHETTI et al. 2004).

Apesar da grande importância social, econômico e ambiental verificada na espécie de Luehea divaricata na bacia do rio Tibagi, nenhum estudo foi realizado até o momento com o objetivo de verificar, em que proporção a variabilidade genética foi atingida após a atividade extrativista na área sendo a preservação da diversidade genética o principal objetivo da biologia da conservação. Portanto, a informação sobre a diversidade genética e/ou estrutura são extremamente importante antes que decisões sobre manejo sejam adotadas.

Neste trabalho reportamos o isolamento e caracterização de locos microssatélites em Luehea divaricata aplicados em diferentes populações na bacia do rio Tibagi, bem como determinamos se há transferência de locos presentes em Luehea divaricata para outras nove espécies de plantas.

Materiais e Métodos

Extração de DNA e construção de bibliotecas de microsatélites

DNA genômico total foi extraído a partir de tecido foliar usando o protocolo de extração de CTAB (DOYLE AND DOYLE 1987). Microssatélites foram isolados com sondas (CT)8 e (GT)8 no passo de enriquecimento. Resumidamente, 5 ng de DNA genômico foi digerido com RsaI e os fragmentos resultantes ligados a dois adaptadores específicos. Os fragmentos contendo repetições CT e GT foram selecionados por hibridização pelos oligonucleotídeos biotinilados, complementares à seqüência e recuperados por estreptavidina presente na superfície de “bolinhas” (beads) magnetizadas (Dynal). Os fragmentos selecionados foram amplificados e a seguir clonados em vetor pGEN-T EASY e então transformados nas E. coli XL1 Blue MRF super-competentes (Stratagene). A seguir o DNA plasmidial das colônias recombinantes (contendo o inserto) foram isolados para poder ser feito o sequenciamento dos insertos. Dos fragmentos seqüenciados foram selecionados os microssatélites utilizando o programa Gramene. De 98 clones seqüenciados, 19 tinham microssatélites, mas apenas dez foram adequados para o desenho dos primers e amplificação de locos polimórficos. Pares de primers complementares às seqüências flanqueadoras dos elementos de repetições foram desenhados utilizando a interface web PRIMER3 software (ROZEN AND SKALETSKY 2000).

Reação de amplificação

Amplificações via PCR foram realizadas com 42 indivíduos de três diferentes populações de L. divaricata, uma com 21 indivíduos e mais duas populações com 11 e 10 indivíduos cada. As reações foram realizadas em 25 μl de volume final, a qual continha buffer, 1U Taq DNA polimerase, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 8 pM de primers reverso e direto, e 20-30 ng de amostra de DNA. As condições para a amplificação via PCR constaram-se de 2 minutos a 94οC, seguidos por 35 ciclos de 45 segundos em 94οC, 1 minuto na temperatura de anelamento no loco específico, 2 minutos a 72οC, e uma extensão final de 5 minutos a 72 οC. Os produtos de microssatélites amplificados foram visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida (acrilamida/bis- acrilamida 29:1) à 7%. 

Análise estatística

Usamos Cervus versão 2.0 (MARSHALL et al. 1998) para estimar o número de alelos por loco (K), heterozigosidade observada e esperada e conteúdo informativo polimórfico(PIC). Os desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg foram determinados utilizando o software Genepop versão 3.4(RAYMOND E ROUSSET 1995).

Resultados e Discussão

Condições de amplificação e características dos dez locos microssatélites são apresentados na Tabela 1. Os dez pares de locos polimórficos produziram um total de 45 alelos, variando de 2 (Ldiv 40, Ldiv 52 e Ldiv 57) a 8 (Ldiv 31 e Ldiv 53) com uma média de 4,5 alelos por loco. A média do conteúdo informativo polimórfico (PIC) foi de 0,546 e os valores de heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) variaram de 0,000 a 0,952 e 0,194 a 0,821, respectivamente. Quatro locos (Ldiv 42, Ldiv 48A, Ldiv 53 e Ldiv 58) desviaram-se das expectativas de equilíbrio de Hardy-Weinberg (P ≤ 0,001) após a correção de Bonferroni para comparações múltiplas, enquanto que vinte e quatro pares de locos exibiram desequilíbrio de ligação significativo (P ≤ 0,01).

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