PREPARO DE MEIOS DE CULTURA, ISOLAMENTO E CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE FOSFATO DE CÁLCIO DA RIZOSFERA DE PLANTAS DE SOJA.

PRÁTICA 1 – PREPARO DE MEIOS DE CULTURA, ISOLAMENTO E CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE FOSFATO DE CÁLCIO DA RIZOSFERA DE PLANTAS DE SOJA.

OBJETIVOS: Realizar o preparo de dois meios de cultura que contém fosfato de cálcio; proceder o isolamento de micro-organismos solubilizadores de fosfato de cálcio pelo método de semeadura em profundidade (pour plate); e, observar o crescimento de unidades formadoras de colônia de bactérias e fungos comparando-se os tipos de meio de cultura.

MATERIAL:

Para meios de cultura

Grupo 1: Meio GL (250 mL) – 2,5 g glicose; 0,5 g extrato de levedura; 3,75 g ágar; 250 mL de água destilada.

Grupo 2: Meio GELP (250 mL) – 2,5 g glicose; 1,25 g peptona; 0,01 g extrato de levedura; 3,75 g ágar; 250 mL água destilada.

Materiais, vidrarias e equipamentos: placas de Petri, bastão de vidro, erlenmeyers, tubos de ensaio com 9 mL de solução salina (NaCl 0,85%), tubos de ensaio com 12,5 mL de solução K2HPO4 (10% = 1,25 g), tubos de ensaio com 25 mL de solução CaCl2 (10% = 2,5g), provetas, pipetas automáticas com volume variável (10µL-100µL e 100µL-1000µL), ponteiras azuis e amarelas, bico de Bunsen, autoclave, banho-maria, agitador de tubos tipo vórtex e câmara de fluxo laminar vertical.

 

PROCEDIMENTOS:

Preparo dos meios de cultura: Pesar os reagentes na ordem indicada, transferir para um bécker, acrescentar a água medindo-a com o auxílio de uma proveta e misturar usando um bastão de vidro. Transferir para um erlenmeyer de 500 mL, tampar com algodão e papel kraft. Identificar o erlenmeyer com o nome do meio de cultura. Autoclavar por 20 minutos à 121 °C. Retirar da autoclave e transferir para o banho-maria a 55 °C para evitar solidificação.

Isolamento de micro-organismos solubilizadores de fosfato de cálcio: Pesar um grama de raízes de soja sem retirar o solo aderido a elas. Na câmara de fluxo, transferir as raízes para um tubo de ensaio contendo 9 mL de solução de salina (10-1), agitar, retirar uma alíquota de 1 mL e transferir para outro tubo com solução salina (10-2). Repetir as diluições sucessivas até 10-6. Retirar 50µL das três últimas diluições (10-4, 10-5 e 10-6), transferir para placas de Petri em triplicatas. Retirar o meio de cultura do banho-maria, levar à câmara de fluxo e acrescentar as soluções de K2HPO4 (10%) e CaCl2 (10%). Misturar até a homogeneização. Verter o meio dentro das placas de Petri com as alíquotas, misturar vagarosamente, e aguardar solidificação. Incubar as placas em estufa, com o fundo para cima (7 dias, 28 °C).

Contagem: Aos sete dias após a incubação, observar o número de unidades formadoras de colônias de fungos e bactérias. A solubilização de fosfato de cálcio será indicada pela formação de halo translúcido ao redor das colônias. Contabilizar: bactérias não solubilizadoras e solubilizadoras, fungos não solubilizadores e solubilizadores. Comparar os resultados entre os três meios de cultura utilizados.

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