As Técnicas de Contagem

RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA

TÉCNICAS DE CONTAGEM

NOME DOS ALUNOS: ANA PAULA MARLY DA SILVA

                                  JOSÉ MARCELINO NETTO

                               JULY BIAS MACEDO

                               LILIAN CAMPELO DE HOLANDA

                               MARIA CLARA DE MORAES GILÓ

                               YAMÊ CAVALCANTI

NOME DO PROFESSOR: SARA OLIVEIRA

Dezembro/2015

RECIFE

1. INTRODUÇÃO

1. CONTAGEM EM CÂMARA DE NEWBAUER

A Câmara de Neubauer é uma lâmina grossa de uso microscópico, com formato retangular e normalmente de vidro, com uma depressão no centro, utilizada para fazer contagem de células por unidade de volume de uma suspensão.

No centro desta lâmina existem várias linhas perpendiculares com marcações em quadrantes (Figura 1). Ao analisar em microscópico com a objetiva de imersão, pode-se perceber que existem três tipos de quadrantes, que juntos formam um quadrado maior. Estes quadrantes são usados para fazer as contagens e assim determinar a concentração de células em um determinado volume de fluido, para poder calcular a concentração de células no líquido global (do qual foi tirado à amostra analisada).

1. CONTAGEM POR PLAQUEAMENTO

A contagem por plaqueamento é um método simples para a determinação da concentração de unidades formadora de colônias (UFC), pois não se utiliza de microscópios ou técnicas sofisticadas. O método se baseia na contagem de colônias após seu período de incubação em placa e na multiplicação pelo fator de diluição escolhido na preparação da placa. Entre as desvantagens desse método, são incluídas o tempo para análise, que é longo quando comparado a outros métodos e quantidade de material (especialmente meio) gasto.

1. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Contagem por plaqueamento

Material

• Amostra: Saccharomyces cervisiae  (solução de fermento prensado em água).
• Meio de cultura: Glicose Agar.
• Diversos: Pipetas  de 1ml, Placas de Petri, tubos de ensaio com 9ml de água estéril, Erlenmeyer com 99ml de água estéril,  Bico de Bunsen.

Técnica

1ª Dia: Para a contagem em placa da amostra contendo a cultura  S. cerevisiae realizou-se diluições até 1x10-7 (Figura 2) e  plaqueou-se, em duplicata, 1ml  das diluições de  1x10-4  até 1x10-7. Colocou-se 1ml de cada diluição em placas e adicionou-se 10 a 20ml de meio de cultura (GA), homogeneizou-se e esperou-se solidificar. A seguir, incubou-se à temperatura ambiente por 24-48 horas.

[pic 1]

Figura 2 – Esquema da técnica de diluições sucessivas.

2º Dia: Após o período de incubação, as placas foram retiradas e foram selecionou-se as melhores placas para realizar a contagem. Essa placa possui um número de colônias entre 30 e 300. Feito isso, a contagem foi realizada a olho nu, contando-se o número de colônias que cresceram no meio.

2.2 Contagem com uso de câmaras de contagem

Material

• Microrganismo: Cultura de Saccharomyces cervisiae.
• Reagentes: Solução salina fisiológica (0,85% NaCl).
• Equipamentos: Microscópio ótico comum; câmara de contagem de Neubauer.
• Diversos: Pipeta Pasteur, bico de Bunsen.

Técnica

- Adicionou-se com uma pipeta Pasteur, uma gota da suspensão da cultura de levedura sobre a área reticulada da câmara;

- Colocou-se a lamínula sobre a gota.

- Esperou-se cerca de dez minutos, até que o material sedimentar;

- Usou-se a objetiva de 40-45X e contou-se as leveduras em cerca de 10 quadrados dispostos em “X” (Figura 3).

[pic 2]

Figura 3 – Câmara de Neubauer.

1. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As técnicas de plaqueamento e contagem direta (com uso de câmaras de contagem) foram ilustradas através dos experimentos utilizando amostras da espécie Saccharomyces cervisiae.

3.1 Contagem na câmara de Neubauer

O corante azul de metileno foi utilizado para diferenciar as células vivas das células mortas, pois as células vivas têm membranas integras, ou seja, não permitindo a passagem do corante ao seu interior, por isso não adquirem nenhuma coloração. Enquanto as células mortas têm suas membranas danificadas, permitindo a entrada do corante no interior da célula, o que lhes confere a coloração azul.

A contagem na câmera foi feita considerando que as células no interior e nas fronteiras (esquerda e inferior) faziam parte de cada quadrado da câmara de Neubauer. O cálculo do número de leveduras/mL na suspensão é feito utilizando a equação 1.

Concentração celular (leveduras/mL) = N x 25000 x fator diluição                        

Sendo N o número total de células (vivas e mortas). Como 1,0 mL da solução de levedura foi misturada com 1,0 mL da solução de corante, o fator de diluição nesse caso é igual a 2. A Tabela 1 mostra o resultado da contagem feita durante o experimento.

Tabela 1 – Quantidade de células vivas e mortas, contagem de levedura na câmara de Neubauer.

De acordo com a Tabela 4, o somatório de células resulta em N=38, ressaltando que como os quadrados 8 e 3 são o mesmo, somente o quadrado 8 foi considerado durante a soma. Substituindo o valor de N na equação 1, temos que a concentração celular é igual a 1,19x106 leveduras/mL. A figura 4 ilustra a câmera de Neubauer com a correspondente numeração utilizada na Tabela 4.

...