QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E IDENTIFICAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

CBS01035 BIOQUÍMICA – BIOTECNOLOGIA

QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E IDENTIFICAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS

16 de Abril de 2018

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1. Introdução

A cinética enzímica é um ramo da Bioquímica que estuda as enzimas em ação; a sua atividade catalítica. No entanto, pode também ser encarada como um ramo da cinética química que estuda as propriedades catalíticas das enzimas. O estudo cinético de uma enzima visa primariamente caracterizar e descrever, a atividade dessa enzima. In vitro estuda-se a atividade da enzima procurando saber que tipo de reações pode catalisar, com que substratos pode interatuar e como se modifica essa atividade (qualitativa e/ou quantitativamente) quando se fazem variar as condições em que é ensaiada. O valor de pH, a temperatura, o tempo de incubação, as concentrações dos substratos, de cofatores ou de outras substâncias (inibidores ou ativadores) são exemplos de condições de ensaio que podem ser modificadas com o objetivo de observar como varia a atividade da enzima, ou seja, como varia a velocidade da conversão ou conversões que a mesma catalisa.

O estudo cinético de uma enzima é feito in vitro. Para esses estudos podem ser usados, como fontes de enzima, preparações que a contenham em estado mais ou menos purificado; quanto mais purificada estiver a preparação enzímica mais fácil será o seu estudo cinético. De acordo com os objetivos definidos não devem estar presentes na preparação, outras enzimas que interfiram no estudo que será feito. Durante o processo de purificação podem ocorrer alterações nas características cinéticas da enzima de tal forma que as características observadas podem não ser as mesmas da enzima no seu estado nativo; além disso, as condições que usamos in vitro para estudar a enzima são diferentes daquelas que a enzima tem na célula. Se o objetivo dos estudos visa compreender o papel da enzima na célula os resultados experimentais devem ser interpretados com especial prudência. Estes estudos podem servir de guia para planear e interpretar experiências realizadas em condições menos artificiais.

A enzima que será estudada em nossos procedimentos práticos será a Pirofosfatase Inorgânica, que está presente em uma variedade de tecidos animais e vegetais. Essa enzima hidrolisa o pirofosfato (H4P2O7 = PPi) em ortofosfato (H3PO4 = Pi). Mediremos a atividade da pirofosfatase inorgânica através da quantificação do produto de sua reação, o Pi, no meio de incubação. Para tanto, será realizada uma incubação da enzima com o seu substrato (PPi) em um meio definido e após um determinado período, a leitura da absorbância relativa ao Pi nessa amostra será realizada em espectrofotômetro, utilizando uma curva padrão de Pi realizada pelo mesmo procedimento para permitir o cálculo da quantidade de Pi nas amostras.

Resultados que podem ser obtifos no estudo cinético de uma enzima:

• Noção de atividade enzímica ou atividade catalítica de uma enzima;
• Noção da velocidade inicial (Vₒ);
• Influência da quantidade de enzima na velocidade de conversão Vₒ;
• Influência da temperatura na atividade enzímica;
• Influência do pH;
• Influência da concentração dos substratos na atividade enzímica e saturabilidade;
• Influência da concentração do substrato em enzimas com “cinética de tipo michaeliano”.

2. Objetivos

Quantificar a atividade da enzima Pirofosfatase Inorgânica e, a partir disso, identificar os parâmetros cinéticos.

3. Materiais e métodos

3.1 Experimento 1 : ATIVIDADE ENZIMÁTICA

3.1.1 Materiais

• Tampão (Tris-HCl 0,1 M; pH 7.2)

• MgCl2

• Substrato PPi
• Íon pirofosfato PPi
• Material enzimático (sobrenadante de tecido hepático)
• Incubadora (“banho-maria”): 37°C
• Molibdato de amônia
• Reagente redutor
• EDTA
• Padrão Pi
• Tubos de ensaio
• Placa de 96 poços
• Micropipeta volume variado 100 – 1000 µl

3.1.2 Métodos

Preparação tubos para ATIVIDADE ENZIMÁTICA

[pic 1]

1. Pipetar os conteúdos conforme a tabela (valores em mL):

2. Após pipetar todos os componentes, adicionar, exceto no tubo do

branco (B), 0,1 mL de material enzimático e inicie a incubação a 370C no banho-maria durante 20 minutos.

3. Após o término da incubação, retirar do banho e pipetar em todos os tubos 5 mL de molibdato de amônia (diluído em ácido sulfúrico 0,5 N).

4. Adicionar 0,1 mL de material enzimático somente ao tubo B

5. Adicionar a todos os tubos 0,4 mL de reagente redutor e agitar.

6. Incubar os tubos por 7 minutos a temperatura ambiente e adicionar 0,2 mL de EDTA 0,1 M.

7. Pipetar, em triplicata, 200 μL de cada tubo por poço da placa de 96.

8. Ler a 640 nm (leia as amostras junto com a curva).

3.2 Experimento 2 : CURVA PADRÃO

3.2.1 Materiais

• Micropipeta volume variável 100 - 1000 µl
• Padrão Pi 1 μmol/ml (μL)
• H2O
• Molibdato de amônia 0,25%
• Reagente Redutor

3.2.2 Métodos

Preparação tubos para CURVA PADRÃO

1. Pipetar os conteúdos conforme a tabela:

[pic 2]

2. Misturar e esperar 7minutos.

3. Adicionar 100 μL de EDTA 0,1 M em cada tubo.

4. Pipetar, em triplicata, 200 μL de cada tubo por poço da placa de 96.

5. Determinar a absorbância a 640 nm.

[pic 3]

4. Resultados e discussão:

Na tabela a seguir, estão demonstrados os valores das absorbâncias das soluções padrão, as concentrações de fosfato e o FCM.

Padrão	Branco	1	2	3	4	5	FCM
1	0,0017	0,081	0,167	0,265	0,327	0,417
2	-0,006	0,082	0,170	0,244	0,336	0,426
3	-0,011	0,074	0,155	0,258	0,341	0,436
AM	0	0,079	0,164	0,256	0,335	0,425
Pi (μmol/L)	0	42,25	84,5	126,7	169	211,26
FC (Pi/AM)	0	534,81	515,24	494,92	504,48	497,08	509,3

A partir do FCM, foram determinadas as concentrações de fosfato formadas durante a reação. Em seguida, esse dado foi utilizado para determinar a velocidade inicial (V0) dividindo o valor encontrado pelo tempo da reação (20 minutos de incubação). A partir da molaridade e dos volumes utilizados para a preparação, foi possível determinar a concentração de substrato (PPi) no início da reação, e então montar a curva de substrato.

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