Relatório de Bioquímica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS[pic 1][pic 2]

FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA DE ALIMENTOS

DISCIPLINA: BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS - TA514

DOCENTES: HÉLIA HARUMI SATO

RUANN JANSER SOARES DE CASTRO

ESTUDO DA TERMOESTABILIDADE DE UMA ENZIMA

Jéssica Sanefuji……………..…………………………………………….....RA: 175832

CAMPINAS - SP

15 de Maio de 2018

1. Introdução

        Enzimas são suscetíveis à distintos fatores ambientais devido à estrutura química que apresentam. Variação de pH, temperatura e atividade de água são os principais influenciadores em atividades enzimáticas. A interferência ocasionada pela variação de pH foi abordada em relatórios prévios, destarte neste relatório consta apenas dados referentes à influência acerca da termoestabilidade na atividade enzimática.

        A termoestabilidade, assim como a desnaturação proteica ou enzimática são processos concernentes à variação de temperatura. Tal alteração pode resultar em ativação ou desativação da atividade enzimática. A gradativa elevação na temperatura culmina em um aumento na energia livre do sistema resultando na diminuição da energia de ativação reacional, no entanto, o aumento deliberado na temperatura pode acarretar na desnaturação da enzima devido ao desdobramento de frações da cadeia polipeptídica, ou seja, devido à mudança da conformação da cadeia, fazendo com que a enzima não apresente mais função biológica. (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010, p. 310)

        Há diversos métodos que podem ser utilizados para determinação de atividade enzimática. Um parâmetro que é utilizado para efetuar tal análise com certa precisão, é a velocidade inicial v0 de determinada reação, cuja enzima encontra-se ativa, mas pode sofrer desnaturação térmica de modo rápido e dessa forma, encontra-se valores sobre a desativação térmica. Não obstante, existe um procedimento prático para a determinação da desnaturação térmica que consiste na incubação da enzima de estudo em temperaturas distintas efetuando análises em sua atividade residual em condições padrão, ou seja, em valores de estabilidade para temperatura e em pH ótimo. (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010, p. 310)

1. Objetivos

Conhecer e determinar a termoestabilidade da α-amilase fúngica (Aspergillus oryzae).

1. Materiais e métodos

1. Materiais

• Amostra 22 alfa-amilase fúngica comercial em 200 mL de água destilada[pic 3]
• Solução de Amido pH 6,0.
• Solução de Iodo - KI (0,3 % I2 + 3% KI em água destilada).  
• Solução HCl 0,1 Mol/L.
• Água destilada
• Tubos de ensaio

1. Métodos

1. Determinação da estabilidade térmica da ɑ-amilase residual

Primeiramente numerou-se 7 tubos de ensaio identificando-os com respectivas temperaturas de tratamento térmico: sem tratamento, 30ºC, 50ºC, 60ºC, 70ºC, 80º e Temp. de Ebulição. Em seguida, adicionou-se 0,2 mL da solução de alfa-amilase em cada, tomando-se cuidado para que a solução não escorra pela parede deste. Tampou-se os tubos com filme plástico e incubou-se nas temperaturas indicadas durante 15 minutos, e o tubo sem tratamento foi deixado na bancada.

        Incubou-se então o tubo contendo substrato de amido a 50ºC por 10 minutos, para se atingir a temperatura ótima de estabilidade.

        Após a incubação com os tratamentos térmicos, os tubos foram retirados da incubação e resfriados em banho maria em béquer de plástico contendo água a temperatura ambiente.

        Com os tubos à temperatura ambiente, adicionou-se 0,8 mL de substrato amido (previamente incubado a 50°C) em cada, tomando-se o cuidado para que não escorra pela parede do tubo. Agitou-se os tubos para homogeneizar e incubou por 5 minutos a 50ºC.
        Após a incubação, adicionou-se 0,5 mL da solução de HCl em cada tubo para paralisar a reação, e agitou-os para homogeneizar a mistura reacional. Em seguida, adicionou-se 0,1 mL de solução de Iodo-KI em cada e completou-se o volume da solução para 15 mL com água destilada. Tampou-se os tubos com filme plástico e misturou-se por inversão.
        Além disso, fez-se o preparo do Tubo “branco” e do Tubo “controle”. O primeiro foi preparado adicionando-se em tubo de ensaio, 0,1mL de solução de Iodo-KI e 14,9 mL de água destilada; o segundo foi preparado adicionando-se em tubo de ensaio 0,8 mL substrato, 0,5 mL da solução de HCl e 0,1 mL de solução Iodo-KI, e agitando-se para homogeneizar, para posteriormente adicionar 13,6 mL de água destilada e completar o volume para 15 mL. Tampou-se ambos tubos com filme plástico e misturou-se por inversão do tubo.
        Por fim, calibrou-se o espectrofotômetro com a solução do Tubo “branco” e mediu-se a absorbância das amostras dos tubos teste e da solução do Tubo “controle” a 620 nm, anotando-se os resultados na Tabela 1.

1. Resultados e Discussões

1. Determinação da estabilidade térmica de ɑ-amilase fúngica

1. Tratamento térmico da enzima

Os resultados obtidos laboratorialmente estão representados na Tabela 1.

        Sendo uma unidade de atividade será definida como a diminuição de 0,001 de absorbância por minuto de reação por mL de enzima alfa-amilase fúngica, o cálculo de Unidades de Atividade de alfa-amilase U/mL foi realizado da seguinte forma, tomando-se temperatura de 30ºC como exemplo:

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