Relatório de Práticas de Bioquímica

Relatório de Práticas de Bioquímica

Práticas: Adição de TCA, Adição de Sal, Adição de Solvente Orgânico, Cromatografia, Reação Com Biureto, Reação com Ninhidrina.
Data: 26/03/2014
Monitor: Junior B.
Alunos: Thaís Bravo e Yasmim Flores.

• INTRODUÇÃO:

As proteínas são moléculas grandes, presentes em todos os seres vivo e formadas por sequências de aminoácidos ligados por ligações peptídicas apresentando, portanto, uma estrutura única e tridimensional. Essa estrutura é o que determinará sua função no organismo dos seres vivos. Quando a proteína está em sua condição mais estável termodinamicamente, exercendo uma função específica biológica, denominamo-las nativa.

Mas, as proteínas podem sofrer um processo de desnaturação, ou seja, perder a sua conformação, já que as ligações fracas responsáveis pelas estruturas secundária, terciária e quaternária são rompidas (pontes dissulfeto e/ou ligações de hidrogênio e/ou interações hidrofóbicas e/ou pontes salinas), levando à precipitação da proteína, perda de sua conformação mais estável e, consequentemente, a perda de sua função biológica.

Agentes físicos e químicos podem levar a tal situação, como: temperatura, solventes orgânicos, altas concentrações salinas, ácidos fortes e agentes caotrópicos. O aumento da temperatura rompe interações por conta da agitação das moléculas, os detergentes e a ureia são capazes de romper interações hidrofóbicas, o pH influência  na carga líquida da proteína, a força iônica interfere na solubilidade da proteína frente a adição de diferentes quantidades de sal, aumentando ou diminuindo a camada de solvatação. A constante dielétrica provoca a exposição de radicais hidrofóbicos em solução apolar, processos de oxidação e redução são responsáveis pela quebra de pontes dissulfeto e o agente caotrópico é responsável por fazer pontes de hidrogênio uma vez que apresenta em sua composição átomos eletronegativos, desestruturando, assim, a proteína.

• MATERIAIS E MÉTODOS:

1. Reagentes: sulfato de cobre; solução diluída de proteínas; solução concentrada de proteínas; solução de ninhidrina; solução de aminoácidos; ácido tricloroacético; solução de sulfato de amônio; solução tampão de fosfato de sódio; etanol gelado; solução contendo compostos de diferentes pesos moleculares.
2. Vidrarias e Aparelhagem: pipeta volumétrica; tubos de ensaio; pipeta Pasteur; centrífuga.
3. Métodos: Cromatografia em coluna, centrifugação, diluição, solução.

• RESULTADOS E DISCUSSÃO

• No teste de reação do biureto, realizou-se um  teste em branco( água destilada + biureto), um com solução de proteínas e outro com solução de aminoácidos. No teste em branco e no de aminoácido não ocorreu nada e a coloração apenas ficou um azulado de intensidade fraca. Já no teste com a solução de proteínas a coloração do tubo de ensaio ficou em tom de azul-violeta .

• No teste de reação de ninhidrina realizou-se um teste em branco;  outro com solução de proteínas e outro com solução de aminoácidos( no caso a prolina que corresponde a um iminoácido) . No tubo de ensaio que continha agua destilada a coloração era incolor; o tubo de ensaio das proteínas apresentava coloração roxa de tom claro e já no tubo de ensaio que continha a solução de aminoácidos a coloração do tubo ficou amarelada.

• No teste de precipitação ácida observou-se que a quantidade de TCA foi suficiente para a desnaturação da proteína visto que o material do sobrenadante posto para reagir com o biureto não apresentou coloração azul-violeta. Desta forma, não havia mais proteínas no sobrenadante.

• No teste de adição de sais foi adicionado NH4SO4 apareceu pouca quantidade de precipitado, pois a concentração do sal não foi suficiente para desnaturação total da proteína. Quando o sobrenadante foi posto para reagir com o biureto confirmou-se tal ideia já que apresentou coloração azul o que indica a presença de proteína.

• No teste de adição de solventes orgânicos (etanol gelado) houve o aparecimento de um precipitado, de uma leve turvação e da formação de um menisco no tubo de ensaio.

• CONCLUSÕES

• Teste com biureto: Os íons Cu2+ presentes em solução, originados do sulfato de cobre, formam um complexo com os aminoácidos, estabelecendo interações com os átomos de nitrogênio da cadeia peptídica. Esse complexo formado confere uma coloração púrpura característica a solução. Esta reação é positiva para proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos. A reação também é positiva para substâncias que contenham dois grupos carbamínicos (-OC-NH2-) ligados diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio.
  
• Teste com ninhidrina: A ninhidrina reage com o grupamento amina (sendo positiva para proteínas, peptídeos, aminoácidos, aminas primárias e amônia) presente nos aminoácidos, formando como produto final um complexo de coloração azul-violeta. Com a prolina que é um iminoácido, forma-se um produto de coloração amarelada.
  
• Teste de precipitação ácida: A solubilidade de uma molécula depende da interação entre os grupos polares dos radicais –R e as moléculas de água através de pontes de hidrogênio. Grandes variações de pH modificam a ionização destes grupos e, portanto, a interação da proteína com o meio. Quando a proteína tem sua conformação modificada afetando a sua função e estrutura pode-se dizer que esta se desnaturou. A desnaturação é um fenômeno que não envolve clivagem da estrutura primária da proteína (ruptura das ligações peptídicas), mas sim, um rompimento das estruturas secundária, terciária e quaternária. A desnaturação é um rearranjo da conformação proteica numa maneira não natural e de escassa ou nula função biológica. Esse fenômeno pode ser acompanhado através de modificações das propriedades físico-químicas da proteína, como a solubilidade: uma proteína desnaturada é insolúvel em água e precipita em solução.

• Teste de adição de sais: No procedimento de precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito da força iônica), deve-se verificar o efeito da concentração destes sais na solubilidade da proteína. Quando sais neutros são adicionados ao sistema ocorre um aumento da força iônica do sistema. Os íons carregados provenientes da dissociação dos sais passam a interagir com as moléculas proteicas, diminuindo a interação entre as próprias moléculas da proteína. Deste modo, temos um aumento na solubilidade da proteína em meio aquoso. A esse fenômeno dá-se o nome de salting-in. Este efeito, porém, não se estende infinitamente. Em condições de elevada força iônica, as moléculas de água apresentam maior tendência de solvatação de partículas (nesse caso, os íons). As moléculas de água, desse modo, interagem mais com os íons, desfazendo suas interações com a estrutura proteica. Como consequência, temos: maiores interações proteína-proteína, resultando na diminuição da solubilidade em meio aquoso. A esse fenômeno dá-se o nome de salting-out.
  
• Teste de adição de solventes orgânicos: No procedimento de precipitação das proteínas por solventes orgânicos, a solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em água. Isso acontece porque a capacidade de interação com as partículas de soluto é diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de interação do solvente com o soluto é denominada constante dielétrica. A água apresenta constante dielétrica bastante elevada (aproximadamente 80). Numa solução contendo, exclusivamente, água e moléculas proteicas temos: interação água - proteína e interação proteína-proteína. Nesse caso, podemos afirmar que o primeiro tipo de interação prevalecerá sobre o segundo porque a água possui grande capacidade de separação das partículas do soluto (constante dielétrica elevada).aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
  
• Cromatografia em Coluna aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa                            
  A prática foi feita pelo monitor, já que a coluna estava com problemas. Foram utilizados vitamina b12 e azul de dissulfina. A molécula maior é quem desce primeiro devido ao fato dela passar entre os poros da rezina, enquanto a menor molécula passa por dentro dos mesmos.

BIBLIOGRAFIA:

http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/proteinas.htm  Acesso em 29/03/2014

http://docentes.esalq.usp.br/luagallo/aminoacidos.html Acesso em 29/03/2014

Apostila de práticas de Bioquimica UFF.

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