REAÇÕES DE COLORAÇÃO E PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

[pic 1]Aula Prática 1: REAÇÕES DE COLORAÇÃO E PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

1. Separação da caseína do leite

O leite possui 3    proteínas    importantes:    caseína, lactalbumina e lactoglobulina. As proporções dessas proteínas variam dependo da espécie do animal. A caseína, proteína separada nesse experimento, constitui cerca de 85% da proteína do leite de vaca e mais ou menos 65% da proteína do leite humano. O termo caseína é atribuído à um grupo heterogêneo de fosfoproteínas que podem ser precipitadas do leite pelo abaixamento do pH normal do leite (6,6 -  6,9) até pH 4,6. As diferentes caseínas encontram-se associadas entre si e também com íons presentes no leite (como o cálcio), formando micelas.

1.1 Objetivo:

Promover a precipitação da caseína do leite pelo abaixamento do pH normal, através   da adição de uma solução de ácido acético, a fim de mostrar sua interferência na solubilidade da proteína em questão.

1.2 Técnica:

Em um béquer de 100 ml colocar 20 ml de leite e agitando, acrescentar 7 ml de solução de ácido acético em torno de 1N. Deixar em repouso por um minuto. Filtrar em tecido de algodão e espremer com o intuito de promover a eliminação de toda a água para a obtenção exclusiva da proteína.

[pic 2][pic 3][pic 4]

1.3 Resultados:

Foi prontamente observada a formação de um coágulo de caseína devido à adição de ácido acético ao leite no tubo de ensaio. Depois de filtrado, o coágulo foi solubilizado novamente por meio   da   adição   de hidróxido de sódio (NaOH) em outro tubo de ensaio.

[pic 5]                                   [pic 6]                           

1.4 Conclusão:

A partir da adição do ácido acético, ocorre a acidificação do leite, ou seja, o abaixamento do pH do meio de 6,6 – 6,9 (pH normal do leite) para um pH de 4,6 (ponto isoelétrico da caseína). Este ponto não apresenta carga efetiva aparente e, portanto, não exibe atuação de forças   eletrostáticas entre   cargas (neutralidade de carga) ocorrendo assim, a precipitação de micelas. Depois da filtração do coágulo foi adicionado hidróxido de sódio, o qual forneceu à caseína cargas que possibilitaram o reestabelecimento de suas ligações (ex.: pontes de   hidrogênio) e   sua   consequente ressolubilização.

1. Reação de coloração a partir de biureto

O biureto é um composto obtido através do aquecimento de duas moléculas de ureia (há também liberação de amônia ao término da reação de formação de biureto). Ele é utilizado para detectar ligações peptídicas. Sendo o resultado do teste positivo, há detecção de, no mínimo, três resíduos de aminoácidos. Sendo negativo, há presença de menos de três resíduos de aminoácidos. O reagente de biureto, utilizado por nós durante a aula prática, é uma solução de sulfato de cobre em meio alcalino.

[pic 7]

        [pic 8]

2.1 Objetivo:

Detectar a presença de ligações peptídicas.

1. Técnica:

Colocar 2 ml do reagente de biureto em cada um dos três tubos de ensaio. Além do reagente, coloca-se 1 ml da solução de caseína no tubo 1, 1 ml da solução de ovoalbumina no tubo 2 e 1 ml da solução de glicina a 0,1 N no tubo 3.

2.3 Resultados:

[pic 9][pic 10]

Observações:

• As soluções dos   tubos   1 (que   continha   caseína) e   2 (que   continha ovoalbumina) apresentaram colorações violáceas por terem reagido com o reagente de biureto.
• O tubo 3 (que continha glicina) manteve sua coloração azulada, pois não reagiu com o biureto.

2.4 Conclusão:

Quando há adição do reagente de biureto em soluções que contenham proteínas ou peptídeos (que apresentem pelo menos duas ligações peptídicas), há   a ocorrência   de   uma   reação química, que   resulta   na constatação   de uma coloração violácea, proporcional as ligações peptídicas, (teste positivo). A intensidade da cor pode ajudar na determinação da dosagem   de proteína em solução. Assim, conforme esperávamos, as soluções de caseína e ovoalbumina apresentaram resultado positivo, pois são proteínas, logo possuem ligações peptídicas. A solução com glicina exibiu resultado negativo, pois a glicina é um aminoácido que é caracterizado pela ausência de ligações peptídicas. A coloração violeta deve-se ao cobre livre na solução que ao interagir com os grupamentos amino dos aminoácidos das cadeias polipeptídicas produzirá uma estrutura organizada e caracteristicamente violeta. O complexo responsável por essa coloração esta apresentado a seguir:  

[pic 11]

[pic 12]

3. Influência do pH na termocoagulação

A maioria das proteínas pode ser desnaturada pelo calor, pois a agitação térmica interfere nas interações estabilizadoras da estrutura tridimensional dessas moléculas. Quando uma solução contendo proteína é aquecida em certas condições, ocorre a formação de flocos insolúveis em água. Este fenômeno é chamado de “coagulação pelo calor”. O termo coagulação normalmente significa uma alteração irreversível na proteína, diferente do que ocorre na precipitação por ácidos ou sais de metais pesados, em que é possível a redissolução do precipitado. Cada proteína tem um ponto isoelétrico e quanto mais próximo desse estiver o meio mais rápida ocorrerá a coagulação.

1. Objetivo:

Caracterizar a influência do pH na termocoagulação.

1. Técnica:

Em um tubo de ensaio, pipeta-se 5 ml de solução de ovoalbumina com 1 ml da solução de NaOH 0,1M. Em outro tubo de ensaio, pipeta-se 5 ml de solução de ovoalbumina com 1 ml de solução tampão pH 4,7. Em seguida, coloca-se os dois tubos em banho fervente por 5 minutos.

1. [pic 13]Resultado:[pic 14]

Observações:

• No tubo 1 (que   continha   ovoalbumina   e   NaOH) não   foi   observada nenhuma ocorrência.
• No tubo 2 (que continha ovoalbumina em solução tampão) foi notado o aparecimento de flocos de proteína, que se mostraram impossíveis de serem solubilizados, até mesmo através de agitação.

3.4 Conclusão:

No tubo 1, houve repulsão entre suas cargas negativas resultantes da ovoalbumina e os íons hidroxila. Assim, houve a solubilização da proteína, uma vez que o pH aumentou e ficou distante do ponto isoelétrico da mesma. Já no tubo 2, houve a coagulação da ovoalbumina, pois o pH da solução tampão era aproximadamente igual ao ponto isoelétrico da proteína. Houve formação de flocos ou grumos   no   tubo   2   pois   o   potencial isoelétrico   foi   atingido.   Uma vez que cada   proteína   tem   seu   ponto isoelétrico característico, a coagulação pelo calor será mais rápida se mais próximo estiver o pH do meio do ponto isoelétrico da proteína. Não foi observada nenhuma ocorrência no tubo 1, pois o pH não alcançou o ponto isoelétrico.

...