SELEÇÃO DE LEVEDURAS PARA PRODUÇÃO DE β-GLICOSIDASE EM CULTIVO SUBMERSO

Marta Lígia Oka1; Ana Paula Aguero de Oliveira2; Gustavo Graciano Fonseca3; Rodrigo Simões Ribeiro Leite4;

1Acadêmica de Engenharia de Alimentos da UFGD, Bolsista de Iniciação Tecnológica e Industrial do CNPq; 2Acadêmica de Mestrado em Biologia Geral da UFGD; 3Professor Doutor da FAEN/UFGD; 4Professor orientador da FCBA/UFGD; Rodovia Dourados - Itahum, Km 12 - Cidade Universitária. Caixa Postal 533 , 79.804-970 Dourados – MS; E-mail: [e-mail]; [e-mail].

RESUMO

A tecnologia enzimática vem despertando bastante interesse do setor industrial, pois além de melhorar a qualidade do produto, geralmente reduzem os gastos energéticos, proporcionam um melhor aproveitamento das matérias-primas e causam baixo impacto ambiental. No entanto, o custo de produção das enzimas ainda é alto, o que inviabiliza o uso dessa tecnologia para algumas aplicações industriais. As β-glicosidases catalisam a hidrólise da celobiose e oligossacarídeos provenientes da degradação enzimática da celulose. Estas enzimas apresentam inúmeras aplicações na indústria de alimentos e bebidas, podendo ser aplicada para produção de biocombustíveis, alimentos funcionais e vinificação. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de diferentes linhagens de leveduras, para produção de β-glicosidase por cultivo submerso. Dentre as 54 linhagens avaliadas, apenas duas apresentaram potencial para produção da enzima. O isolado 28 apresentou apenas atividade intracelular com 0,67 U/mL, enquanto o isolado MA apresentou 0,12 U/mL intra e extracelular. Os resultados obtidos estimulam a continuidade do trabalho, visando a identificação taxonômica das linhagens selecionadas, com o intuito de descrevermos novas fontes microbianas produtoras de enzimas de interesse industrial.

Palavras-chave: Bioprospecção; Fermentação Submersa; Celulases Microbianas.

INTRODUÇÃO

Atualmente diversos setores industriais utilizam enzimas para melhoramento do produto ou até mesmo dos processos. As enzimas são moléculas protéicas que catalisam reações químicas, aumentando a velocidade da geração dos produtos. Estas moléculas apresentam especificidade aos seus substratos, são biodegradáveis e geralmente não oferecem riscos a saúde. Dentre as enzimas mais utilizadas pelo setor de alimentos estão as celulases, um complexo de enzimas que atuam de forma sinérgica sobre a hidrólise das ligações glicosídicas β-1,4 das moléculas de celulose, podendo ser aplicas na indústria de alimentos e bebidas, biocombustíveis e ração animal (SANTOS, 2011).

A hidrólise enzimática do material celulósico envolve a ação de três enzimas diferentes: a endoglucanase ou endo-β-1,4-glucanase (EC. 3.2.1.4) hidrolisa as cadeias ao acaso, atacando os polímeros internamente, resultando em uma rápida redução no tamanho da cadeia ou grau de polimerização, a exoglucanase ou exo-β-1,4-glucanase ou celobiohidrolase (EC. 3.2.1.91) atua sobre a celulose, removendo unidades de celobiose a partir de extremidades não redutoras da molécula e a β-1,4-glicosidase ou celobiase (EC. 3.2.1.21) hidrolisa celobiose e outras celodextrinas a glicose (SOUZA et al., 2010).

A presença de β-glicosidase no processo de vinificação favorece a liberação de compostos aromatizantes a partir de seus precursores glicosídicos. Tais compostos são coletivamente chamados de terpenos, dentre eles estão nerol, α-terpineol, geraniol, linalool, citronellol e outros, quando glicosilados, apresentam baixa volatilidade e pouco contribuem para o aroma do vinho (BAFFI et al., 2011). Outra aplicação das β-glicosidases consiste na hidrólise das isoflavonas presentes na soja, aumentando a absorção destes compostos pelo trato intestinal humano (OTIENO e SHAH, 2007). Trabalhos anteriores relatam que uma dieta rica em isoflavonas pode contribuir para o controle e prevenção de muitas doenças crônicas, tais como: câncer (mama, próstata e cólon), osteoporose, sintomas da menopausa, doenças cardiovasculares e outras (CARRÃO-PANIZZI e BORDINGNON, 2000; RIELD et al., 2005).

A utilização de leveduras para produção de enzimas oferece algumas vantagens, como: temperaturas moderadas para o crescimento microbiano, elevada diversidade metabólica, rápido crescimento celular resultando em ciclos de fermentação menores e fácil adaptação a diferentes condições de cultivo (SILVA-NEVES et al., 2006; KATO et al., 2007).

Tendo em vista a importância biotecnológica das β-glicosidases, o presente trabalho teve como objetivo selecionar linhagens de leveduras com potencial para produção desta enzima, por cultivo submerso.

MATERIAIS E MÉTODOS

Microrganismos

Neste trabalho foram analisadas 53 linhagens de leveduras pertencentes à Rede Centro-Oeste de Leveduras (RECOL – Brasil – MS) e 1 linhagem de Saccharomyces cerevisiae comercial (CAT), cedida pela Usina São Fernando Açúcar e Álcool Ltda, localizada no município de Dourados-MS. As linhagens da RECOL foram isoladas de ambientes naturais e industriais, como: frutos do cerrado, cama de frango e mosto de usinas sucroenergéticas.

Preparo do inóculo

As linhagens foram cultivadas em tubos de ensaio contendo 5 mL de meio YEPD (extrato de levedura 1%, peptona 2%, glicose 2% e agar 1,5 %) por 48 horas a 28ºC. Obteve-se a suspensão da levedura pela raspagem suave da superfície do meio, empregando 3 mL do próprio meio fermentativo. A inoculação das leveduras no meio fermentativo foi realizada pela transferência de 3 mL da suspensão microbiana.

Seleção das linhagens promissoras por cultivo submerso

As leveduras foram cultivadas em frascos Erlenmeyer de 125 mL, contendo 20 mL de meio composto de extrato de levedura 1%, peptona 2%, celobiose 2% (m/v). Posteriormente ao inóculo, os frascos foram mantidos a 28°C por 48 horas a 150 rpm. Todos os ensaios foram realizados em duplicatas.

Obtenção dos extratos enzimáticos

Os meios cultivados foram centrifugados a 1000 x g por 5 minutos a fim de separar a massa celular do sobrenadante, sendo o último denominado extrato enzimático extracelular. A massa celular foi ressuspendida com 5 mL de tampão acetato e centrifugada a fim de eliminar as impurezas. O procedimento foi repetido e após a última centrifugação, a massa celular foi ressuspendida com 10 mL de tampão acetato, sendo denominado de extrato enzimático intracelular. Os extratos enzimáticos foram utilizados para os ensaios de determinação de β-glicosidase.