Seleção de BAL autóctones do leite caprino com características probióticas

Seleção de bactérias do ácido lático autóctones do leite caprino com características probióticas

Selection of autochthonous lactic acid bacteria from goat milk with probiotic characteristics

Ana Aparecida de Castro Marinho¹, Jane Viana de Souza¹, Isabela Felipe Miyasato¹, Íris da Silva Ferrari¹, Francesca Silva Dias¹

¹Universidade Federal do Vale do São Francisco, Rod. BR 407, Km 12 - Lote 543 - Projeto de Irrigação Senador Nilo Coelho, s / nº - C1, 56,300-990, Petrolina, Pernambuco, Brasil

Resumo 

Este estudo teve como objetivo selecionar Bactérias do Ácido Lático (BAL) autóctones do leite caprino com características probióticas. Testes in vitro, incluindo análise da sobrevivência ao Trato Gastrointestinal (TGI), autoagregação e coagregação aos patógenos Salmonella typhi e Listeria monocytogenes. Ainda, para os melhores isolados, testes adicionais como desconjugação de sais biliares, β-galactosidase e a atividade de descarboxilase foram realizados. Todas as estirpes selecionadas apresentaram taxa de sobrevivência ao TGI superior a 90%. O isolado UNIVASF CAP 84 apresentou alta capacidade autogregativa. Na coagregação, o isolado UNIVASF CAP 45 exibiu o maior percentual coagregativo com o patógeno S. typhi. Desconjugação de sais biliares, bem como atividade β-galactosidase, foi observado nos isolados testados. Nenhum isolado foi capaz de descarboxilar aminoácidos. Assim os isolados UNIVASF CAP apresentam propriedades promissoras para emprego como probiótico em alimentos.

Palavras-chave: BAL; Probiótico; Leite de cabra.

1. Introdução

Os maiores rebanhos caprinos do Brasil estão localizados no estado da Bahia e Pernambuco, na região semiárida, especificamente em Petrolina-PE e Juazeiro-BA (IBGE, 2011). Os produtos lácteos caprinos da região possui grande importância econômica e social. A incorporação BAL poderia contribuir para agregação de valor a estes produtos. Sabe-se que micro-organismos probióticos como BAL devem sobreviver ao TGI, possuir bom percentual agregativo e serem capazes de desempenhar suas funções benéficas no hospedeiro. A desconjugação de sais biliares no intestino por BAL pode contribuir para a diminuição do colesterol sérico (ANANDHARAJ; SIVASANKARI, 2014). Ainda, como benefício a saúde, BAL que possuem a enzima β-galactosidase ativa, podem hidrolisar a lactose diminuindo os transtornos intestinais, tais como as provocadas por indivíduos com intolerância à lactose (NIE et al., 2013). Desta forma, este estudo teve como objetivo selecionar estirpes de BAL com características probióticas.

2. Material e Métodos

2.1. Pré-seleção e identificação dos isolados

Um total de 58 BAL pré-selecionados entre 290 isolados foram utilizadas neste estudo. Essas cepas foram isoladas do leite caprino de fazendas leiteiras em pequena escala, com cabras de raças mestiças em seis municípios da região semiárida do Nordeste (ALMEIDA JUNIOR et al., 2015). Dez fazendas foram selecionadas aleatoriamente de cada município totalizando 58 amostras de leite. A caracterização básica dos isolados foi realizada através da reação de Gram, morfologia, motilidade, catalase (H2O2, 3% vol / vol) e atividade citocromo oxidase. Em sequência, a pré-seleção dos isolados de BAL baseou-se na sua capacidade de tolerância aos efeitos do pH baixo. Assim, foram selecionados 58 isolados com uma taxa de sobrevivência superior a 90% a pH 2 (SOLIERI et al., 2014) para os testes descritos abaixo.

2.2. Simulação à tolerância no TGI dos isolados UNIVASF CAP selecionados

Para simular a sobrevivência ao TGI, os 58 isolados de BAL foram testadas in vitro que quimicamente simulou as condições fisiológicas. Para bile, o meio foi preparado com caldo MRS suplementado com 2% de bile bovina. Para o teste de tolerância ao fluido pancreático, foi realizada uma solução de 150 mM de NaHCO3, 1,9 mg/mL de pancreatina e ajustado ao pH 8, como sugerido por Rönkä et al. (2003). No teste de tolerância ao suco intestinal, preparou-se uma solução segundo Bao et al. (2010), onde foram adicionados tripsina e sais biliares numa solução estéril de NaHCO3 com NaCl em água destilada. O pH foi ajustado para 8,0 com NaOH 0,5 M. A solução foi esterilizada por filtração através da membrana com poros de 0,45 µm. Os isolados testados em cada meio foram cultivados durante 24 h em caldo MRS e incubados a 37 °C. Após este período, as amostras foram centrifugadas durante 5 min e lavadas três vezes em tampão fosfato salino (PBS) com pH 7,0. Os tubos contendo células e meio teste foram incubados durante 3 h a 37 °C. Para estudar a viabilidade, as estirpes foram semeadas no tempo 0 e 3 h em ágar MRS (Himedia). As taxas de sobrevivência foram calculadas de acordo com a seguinte equação: Taxa de sobrevivência (%) = log UFC N1 / LOG UFC N0 x 100. Onde N1 representou a contagem total de estirpes viáveis no tempo de 3 h, e N0 representou a contagem total de estirpes viáveis no tempo 0 h.

2.3. Atividade de agregação

2.3.1 Autoagregação e Coagregação

O procedimento foi conforme descrito por Kos et al. (2003). Para o teste de autoagregação, 4 mL da suspensão celular contendo 108 UFC/mL foram homogeneizadas em vortex por 10 segundos e incubados a 37 °C. Foram retiradas alíquotas de 5 μL nos tempos de 1, 2, 3, 4 e 5 horas, transferidas para microplaca contendo 195 μL de PBS pH 7,2 e lida as absorbâncias a 620 nm. Para calcular a porcentagem de autoagregação, foi utilizada a seguinte equação: 1-(A0/At) x 100, onde At representa a absorbância nos tempos: 1, 2, 3, 4 e 5 horas e A0 a absorbância no tempo zero. No teste de coagregação, a metodologia empregada para a suspensão celular foi a mesma do teste de autoagregação. Para o teste, os agentes patogénicos utilizados foram: Salmonella typhi (ATCC 6539) e L. monocytogenes (ATCC 7644). Os micro-organismos foram testados em pares (2 mL de suspensão celular, sendo patógeno e BAL). E foi realizado um grupo controle contendo os microrganismos separados, para calcular a porcentagem de coagregação.

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