A Cinética Bioquímica

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LICENCIATURA EM QUÍMICA

Cinética Enzimática

Disciplina: Bioquímica

Professor: Ivanilton Nery

Alunos:

Flavia Tavares Teixeira

Lidiane Nascimento

Luiz Paiva

1º semestre/2015

OBJETIVO:

Estudar a velocidade da reação da enzima invertase em meios com diferentes concentrações de substratos, pH e temperatura.

Estudar a aplicação tecnológica do ácido ascórbico.        

INTRODUÇÃO:

        O estudo da velocidade de reações que utilizam enzimas se chama Cinética Enzimática. De acordo com a literatura basicamente três fatores influenciam a velocidade de uma reação, a concentração do substrato, o pH do meio e a temperatura do meio.

        A enzima escolhida para estudo é a invertase, obtida a partir de células do microrganismo Saccharomycescerevisae levedura importante principalmente no processo de fabricação do pão e de cervejas.

        O açúcar; substrato; utilizado para o estudo é a sacarose, entretanto, esse açúcar não é redutor. Sendo assim, a velocidade a velocidade da reação da hidrólise catalisada pela enzima será determinada pela formação de açúcares redutores.

        Após cada etapa da prática; estudo da concentração, pH e temperatura; será realizada a análise dos dados experimentais. A quantificação dos açúcares redutores será realizada por meio da técnica de espectrofotometria de UV-visível, utilizando como reagente colorimétrico o DNS (ácido ,5-dinitrosalicílico) quanto mais forte a cor do meio maior a concentração de açúcares redutores no meio. A resposta do espectrofotômetro é um determinado valor de absorvância para cada amostra. Sabendo-se a concentração de sacarose inicial em cada amostra, será possível elaborar um gráfico da absorvância como função da concentração de glicose do meio.

Com a elaboração do gráfico será possível relacionar os aspectos da curva encontrada com os conceitos teóricos estudados, como pro exemplo a velocidade enzimática máxima.

A prática ainda teve por objetivo estudar a aplicação tecnológica do ácido ascórbico. Sabe-se que o ácido ascórbico é amplamente utilizado em sucos de maçã industrializados. O ácido ascórbico, também chamado de vitamina C é um poderoso antioxidante encontrado principalmente em frutas cítricas como acerola, limão, laranja, kiwi e outras.

        

        

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MATERIAIS:

• Tubos de ensaio 10 X 150 mm;
• Banho de água à 37ºC;
• Banho de água fervente;
• Banho de gelo;
• Pipetas de 2, 5 e 10 ml;
• Becheres de 400 e 600 ml;
• Estante para tubos de ensaio.
• 7 tubos de ensaio com tampa;
• 1 tubo de ensaio 10 X 150 mm contendo 15 ml de DNS;
• 1 tubo de ensaio 10 X 150 mm contendo 7 ml de invertase;
• 1 tubo de ensaio 10 X 150 mm contendo 7 ml de solução de sacarose a 25 mmol/l em tampão acetato pH 5,0;
• 1 tubo de ensaio 10 X 150 mm contendo 7,5 ml de tampão acetato pH 5,0;
• 1 tubo de ensaio com tampa contendo 1,5 ml de solução de sacarose a 0,2 mol/l em tampão acetato pH 3,6;
• 4 tubos de ensaio com tampa contendo 1,5 ml de solução de sacarose a 0,2 mol/l em tampão acetato pH 5,0;
• 1 tubo de ensaio com tampa contendo 1,5 ml de solução de sacarose a 0,2 mol/l em tampão fosfato pH 8,0;
• 1 estante para tubos de ensaio;
• 4 pipetas de 2 ml;
• 2 pipetas de 5 ml;
• 1 pipeta de 10 ml;
• 2becheres de 600 ml;

REAGENTES:

• Enzima invertase;
• Tampão acetato pH 5,0;
• Solução de sacarose a 25 mmol/l (9,5 g/l) em tampão acetato pH 5,0;
• Solução de ácido 3,5-di-nitro-salicílico (DNS);
• Água destilada.
• Solução de sacarose a 0,2 mol/l (6,8 g/100 ml) em diferentes tampões (acetato pH 3,6; acetato pH 5,0 e fosfato pH 8,0).

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:

        Influência da Concentração de Substrato:

        Em 7 tubos de ensaio com tampa, enumerados de 1 a 7, adicionou-se tampão acetato pH 5,0 e solução de sacarose 25 mmol/l conforme indicado pela tabela abaixo:

REAGENTES	TUBO 1	TUBO 2	TUBO 3	TUBO 4	TUBO 5	TUBO 6	TUBO 7
Tampão acetato pH 5,0 (ml)	2,0	1,8	1,6	1,0	0,5	0,2	0,0
Solução de Sacarose 25 mmol/l (ml)	0,0	0,2	0,4	1,0	1,5	1,8	2,0

Tabela 1: Descrição dos volumes de substratos.

Colocou-se os 7 tubos e o tubo contendo a enzima em banho de água à 37ºC por 5 minutos (aclimatação); Retirou-se os tubos do banho e adicionou-se em cada tubo, 0,5 ml de enzima. Incubou-se os tubos a 37ºC por 15 minutos para que a hidrólise acontecesse. Adicionou-se 1 ml de DNS, em cada tubo, para paralisar a reação, retirou-se imediatamente do banho e levou-se ao banho de água fervente por 5 minutos; Em seguida, retirou-se os tubos do banho fervente e os resfriou em água corrente, adicionou-se, em cada tubo, 6,5 ml de água destilada e homogeneizou-se.

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