A Quimica Orgânica

Análise quantitativa por HPLC-MS/MS de toxinas em sementes de soapberry: Metileno Ciclopropil Glicina e hipoglicina A

Química Analítica II

Introdução

Hoje vamos falar sobre a quantidade de Metileno Ciclopropil Glicina e hipoglicina A em soapberry, utilizando HPLC e espectroscopia de massa.              (s1)

O objetivo deste trabalho é analisar a quantidade destas toxinas presentes neste fruto utilizando técnicas e parâmetros analíticos.      (s2)

Soapberry (Sapindaceae)  é uma espécie de fruto vermelho amargo, mas comestível, proveniente do Canadá. (s3)

Durante esta investigação, foi observado que pode conter toxinas como: Metileno Ciclopropil glicina (MCPG) e hipoglicina A (HGA).

Estas substâncias são aminoácidos que demonstraram causar hipoglicemia (níveis baixos de açúcar/glicose no sangue) e encefalopatia (é uma disfunção cerebral causada por insuficiência hepática, as substâncias tóxicas normalmente eliminadas pelo fígado acumulam-se no sangue e chegam ao cérebro).

Métodos Utilizados

Cromatografia líquida de alta eficiência HPLC

É uma técnica de separação de componentes de uma mistura, neste tipo de cromatografia, a fase móvel é líquida e a fase estacionária pode estar distribuída sobre uma superfície plana ou no interior da coluna.

Este método permite análises rápidas, precisas e eficientes, é capaz de separar uma grande variedade de componentes como: proteínas, vitaminas entre outros.

Neste artigo foi utilizado o  Agilent 1260 Infinity series (Santa Clara, CA, EUA)

Vantagens

• Análises mais rápidas
• Mais eficiente do que a cromatografia de coluna clássica, devido a ser possível usar partículas de dimensões reduzidas sendo necessário utilizar pressões mais elevadas para forçar a passagem de fase móvel através da coluna.
• volume injetado é melhor controlado
• eluente compete com a fase estacionária pelas moléculas dos solutos, possibilidade de jogar com um maior nº de variáveis
• compostos não voláteis ou instáveis por aquecimento podem ser analisados por esta técnica

Desvantagens

• Equipamento de alto custo
• Experiência de manuseio 

Espectroscopia de Massa

A espectroscopia de massa é utilizada para detectar e identificar fórmulas moleculares exactas de moléculas grandes ou pequenas, em fase gasosa, por meio da medição da sua massa e da caracterização de sua estrutura química.

O princípio básico de um espectrômetro de massa consiste em criar iões moleculares por um método adequado, separá-los de acordo com a sua relação de massa/carga (m/z) e, por fim, detetá-los qualitativa e quantitativamente por sua respetiva taxa massa/carga e abundância.

Neste artigo foi utilizado o Thermo Scientific Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Waltham, MA, EUA)

Vantagens

• Quantificação da concentração de compostos
• Sensível e seletiva
• Permite a detecção de compostos em concentrações muito baixas

Desvantagens

• Alto custo de equipamento
• Possibilidade de contaminação da amostra

Procedimento Experimental

Material   

Aqui temos o material utilizado

 Reagentes:

Neste método foram utilizadas: sementes de 5 Rambutans (N. lappaceum), 5 longan (D.longan), 6 mamoncillos (M. bijugatus), um ackee (B. sápida), e 26 lichias (L. chinensis). Este teste incluiu as sementes do mesmo fruto de soapberry cujos arilos foram testados, os frutos foram comprados entre maio de 2015 e maio de 2016. Os frutos enlatados não foram testados devido à inexistência de sementes.

Tratamento e discussão dos resultados
     Deteção e separação

Efeitos da matriz inicial foram avaliados para determinar se as sementes de rambutão (N. lappaceum) seria um branco de matriz adequado para os calibradores do método.

Para tal, infundiu-se uma solução de 200 ng/mL de dns-MCPG e dns- HGA em água enquanto se injetava 1 mg/mL de branco de matriz, não se tendo verificado qualquer efeito de matriz.

A intensidade do sinal do pico do calibrador mais baixo foi três vezes superior à do branco da matriz para ambos  os analitos.

Quadro 1A

Exatidão e precisão da diluição de MCPG em extrato de sementes de rambutan até 20,0 mg/g de sementes secas (n = 3).

Quadro 1B

Exatidão e precisão da diluição de HGA no extrato de sementes de rambutan até 20,0 mg/g de sementes secas (n = 3).

Para além da gama de calibração do método (1-200 ng/mL), foram avaliadas experiências de diluição a concentrações de 20 µg/mL (20 mg/g de sementes secas). O branco da matriz foi enriquecido com níveis conhecidos de MCPG e HGA e depois diluídos para ajustar a curva de calibração com um erro ≤17%.

    Precisão, exatidão e linearidade

A precisão, a exatidão e a linearidade foram avaliadas durante a caracterização do método da matriz de sementes para MCPG e HGA (Quadro 2). A Precisão (% RSD) e exatidão (% RE) foram <15% para todas as amostras.

• Os materiais de controlo de qualidade? no branco da matriz foram monitorados durante a análise e enquadram-se nas diretrizes de alimentos e veterinários da FDA para a validação de métodos químicos para medições de exatidão e precisão menores que 15% (FDA, 2015)

Amostragem, extração e robustez analítica

A robustez da preparação de amostras de sementes deste fruto foi avaliada através da análise da precisão das amostras Intra semente (1,0- 3,0 mg), utilizaram seis amostras replicadas de uma única semente e o valor relativo do desvio-padrão foi ≤16% tanto para o MCPG como para o HGA (quadro 3).

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