ESPECTROFOTOMETRIA E DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE BIURETO

[pic 1]

Graduação em Ciências e Tecnologia

RELATÓRIO 3:

ESPECTROFOTOMETRIA E DOSAGEM DE PROTEÍNAS

PELO MÉTODO DE BIURETO

OBJETIVO:

Determinar o espectro de absorção UV-visível do complexo formado entre os íons Cu2+ presentes no reagente de Biureto e proteínas. Utilizar o comprimento de onda de absorbância máxima para a elaboração de uma curva-padrão e determinação da absortividade. Calcular a concentração de proteína em uma solução de albumina bovina. Estudo da estrutura de proteínas.

MATERIAIS:

- Reagente de Biureto

- Papel absorvente macio para limpeza das cubetas

- Água destilada

- 2 Pipetas volumétricas de 2 mL

- Espectrofotômetros

- Cubetas

- Pêra

- Estante

-9 tubos de ensaio

- Agitador tipo vórtex

- Soluções-padrão de Albumina de Soro Bovino (BSA) com as seguintes concentrações em % (m/v):

0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 e 1,75.

- Amostra de concentração de proteína desconhecida

RESULTADOS:

Seguindo as instruções acerca do procedimento experimental, o grupo conseguiu adicionar o Biureto à solução, aumentando a concentração de solução de Albumina. Quanto mais a concentração da solução aumentou, teve um aumento proporcional da absorbância, sendo a transmitância variável.

À partir das medidas de absorbância realizadas, construímos a curva analítica e, desta, pudemos calcular a concentração do tubo 2 (amostra de concentração de proteína desconhecida).

DISCUSSÃO:

Ao se incidir luz através de um material, fótons de determinados comprimento de onda serão absorvidos somente quando estes possuem a energia que corresponde à diferença entre dois níveis energéticos dos átomos do material que estão atravessando. Essa energia é transmitida para o material, e o feixe que está sendo incidido têm uma diminuição na quantidade de fótons por segundo, naquele determinado comprimento de onda, sendo assim diminuído.

CONCLUSÃO:

Através desse experimento, pudemos concluir que com a incidência de luz em uma solução, é possível determinar o espectro de absorção. Partindo do comprimento de onda de absorbância máxima e, através de uma curva-padrão, definir a absortividade. Com ela foi possível calcular a concentração da amostra de proteína em solução de BSA.

PERGUNTAS:

1. Plotar a absorbância da amostra do item 1 em função do comprimento de onda, determinando o comprimento de onda de máxima absorbância.

[pic 2][pic 3]

Figura 0: Gráfico da absorbância em função do comprimento de onda

Analisando o Gráfico podemos observar que o comprimento de onda com uma maior absorbância é o de 550 nm.

1. Plotar as absorbâncias das soluções padrão em função da concentração e calcular a absortividade.

Seguindo o procedimento experimental, o grupo obteve os dados contidos na tabela 1, onde o tubo 1 contém a concentração desconhecida da proteína albumina e o tubo 2 era o branco. Levando em consideração que a massa molar da albumina [BSA] é de 66,430 g/mol, será possível utilizar este valor para converter os valores em % para mols/L, onde facilitará o cálculo da absortividade em seguida. Esta conversão é feita a partir de uma regra de três. Ex: 66,430 g de albumina estão para 1 mol, assim como 1,25 g/L de albumina está para X mols.

[pic 4]

Tabela 1: Tabela relacionando a concentração de albumina mediante sua devida absorbância

Deste modo, foi possível construir uma curva analítica como demonstrado pela figura 1, sendo possível então calcular a concentração de albumina do tubo 2, até então desconhecida. Vale ressaltar que os pontos dos tubos 8 e 9 foram retirados para assim manter a reta da curva analítica linear.

[pic 5]

Figura 1: Gráfico da concentração em função da absorbância

Outro jeito de calcular a concentração do tubo 2 seria deduzindo a absortividade, ou extinção molar, através dos dados da tabela 1, utilizando assim a equação de Lambert-Beer como consta abaixo:

A = a.b.c

Onde A = absorbância, a = absortividade, b = caminho óptico e c = concentração.

Sabendo que a cubeta utilizada na leitura com o espectrofotômetro ter tamanho 1 cm, e, rearranjando a equação, temos que, para o comprimento de onda 550 ƞm, a absortividade é:

a550= A/b.c

Realizando os devidos cálculos, chegou-se aos seguintes valores de absortividade, presentes na tabela 2, onde pode-se notar que os valores divergiram por pequenas diferenças. Sendo assim, o grupo desconsiderou os valores de absortividade nos tubos 3, 8 e 9, adotando um coeficiente de extinção molar de 2,92.

...