Determinação Microscópica de Concentração Celular Modelo Original

Data / Date

Descrição das Mudanças / Changes Decription

20/06/2013

Adaptação do Procedimento Operacional Padrão “SOP.017.01.PT – Determinação microscópica de concentração celular / Adaptation of the Standard Operation Procedure SOP.017.01.PT - Microscopic Determination of Cell Concentration

1. Objetivo:

Procedimento para determinação da concentração de células microalgais em cultivos líquidos.

1. Aplicabilidade:

Este procedimento é utilizado no Laboratório de Microbiologia para acompanhamento de análises de amostras de banco de células, cura de crescimento, fermentação e outros.

1. Responsabilidades:

3.1. Técnico de Laboratório:

3.1.1. O Técnico de laboratório deve utilizar técnicas de assepsia adequadas e uso de equipamentos de proteção necessários para preservação da amostra e integridade dos funcionários.

3.1.2. O Técnico de Laboratório deve documentar apropriadamente os procedimentos e leituras realizadas.

3.1.3. O Técnico de Laboratório deve comunicar ao superior hierárquico quaisquer desvios ocorridos na elaboração de suas tarefas e obtenção de resultados não conformes.

Gerente de Laboratório: 

O Gerente de Laboratório deve exigir o correto cumprimento dos procedimentos para execução das tarefas.

Presidente da CIBios (Comissão Interna de Biossegurança):

O Presidente da CIBio é responsável por avaliar e revisar todas as propostas de manipulação de OGM (Organismos Geneticamente Modificados), identificar todos os riscos potenciais aos técnicos, à comunidade e meio ambiente e fazer recomendações sobre o risco de manipulação e manejo.

1. Procedimento:

4.1        Cuidados:

4.1.1. O técnico de Laboratório deve utilizar avental de manga comprida, luvas de procedimento (nitrila) e óculos de segurança.

4.1.2. Usar técnicas de assepsia adequadas.

4.2        Equipamentos:

4.2.1. Agitador de tubos tipo vortex.

4.2.2. Cabine de segurança biológica.

4.2.3. Micropipetadores (10 µL, 200 µL e 1000 µL).

4.2.4. Microscópio óptico.

4.3        Reagentes ou Materiais:

4.3.1. Câmara de Neubauer.

4.3.2. Lenço de papel sem celulose (Kimwipes).

4.3.3. Micropipetadores (10 µL, 200 µL e 1000 µL.

4.3.4. Microscópio óptico.

4.3.5. Microtubos de 1,5 – 2,0 mL.

4.3.6. Ponteiras de micropipeta.

4.3.7. Raque para microtubos.

4.3.8. Etanol 70%.

4.3.9. Água desmineralizada estéril.

4.4        Instruções:

4.4.1. Coletar 1 mL da amostra a ser avaliada por microscopia.

4.4.2. Homogeneizar a amostra em vortex.

4.4.3. Preparar a diluição apropriada para visualização celular, utilizando água desmineralizada estéril. As suspensões devem ser diluídas suficientemente para

que as células não se sobreponham umas às outras na grade, devendo aparecer uniformemente distribuídas.

4.4.4. Preparar a câmara de contagem limpando com cuidado a superfície espelhada e a lamínula com papel adequado (Kimwipes) e etanol 70%.

4.4.5. Colocar a lamínula e fixá-la sobre a câmara de contagem antes de aplicar a suspensão celular como mostrado na Figura 1.

[pic 2]

Figura 1. Câmara de contagem

4.4.6. Homogeneizar a amostra diluída e coletar 10 uL com micropipeta de 10 uL,100uL ou de 200 uL.

4.4.7. Introduzir 10 uL, com micropipeta, na extremidade entre a câmara e lamínula para cobrir totalmente a superfície, como mostrado na figura 1.

4.4.8. Colocar a câmara carregada no microscópio e focar, aumentando gradativamente a intensidade luminosa até adequada visualização. A câmara de Neubauer pode ser integralmente visualizada com a objetiva 10x.

Figura

[pic 3]Área de contagem[pic 4]

Figura 2. Área de contagem.

Pode-se notar que os quadrantes têm sub-divisões diferentes, fazendo com que o critério para escolha do quadrante onde serão contadas as células, seja o tamanho dos células a serem quantificadas. Células pequenas são contadas no quadrante C, as de tamanho intermediário no quadrante B, e células grandes são contadas no quadrante A.

A área total compreendida pelos 9 quadrantes é de 9 mm2 sendo que cada quadrante (A, B e C) são quadrados de 1 x 1 mm. Ao ser colocada a lamínula (especial para ser usada na câmara de Neubauer) a distância da lamínula até a lâmina (profundidade) mede 0,1 mm, o que permite se obter um volume de 0,1 mm3 em cada quadrante.

4.4.9. Contar as células nos quadrantes selecionados de modo que a contagem total seja maior que 100 células, número necessário para significância estatística da contagem.

4.4.10. A seguinte fórmula deve ser usada para acessar a concentração celular na suspensão:

no células de um quadrante grande x 104 x fator de diluição = número de células/mL

1mL

4.4.11. Higienizar a câmara de Neubauer e a lamínula após a contagem com etanol 70%, secar com kimwipes, armazenar na caixa de acrílico específica e guardar em local apropriado para não quebrar. NOTA: Não deixar secar amostra sobre a câmara e não deixá-la de molho em nenhuma solução para não danificá-la.

4.4.12. Registrar o uso do microscópio óptico no caderno de registros do mesmo.

4.5. Notas - Regras de contagem:

4.5.1. Contar as células usando o quadrado grande do centro.

4.5.2. Contar as células dos quadrados médios e as células que estiverem tocando as linhas superiores e as linhas à direita.

4.5.3. Contar cerca de 100 a 300 células para determinar o número de células/mL.

4.5.4. Ao se realizar a contagem de várias amostras, sempre higienizar a câmara e a lamínula com etanol 70% entre uma amostra e outra.

1. Referência:

5.1. A operação e manutenção dos equipamentos deste sistema devem seguir os manuais dos fabricantes.

5.2. Method Counting Chamber Rice University. Disponível em:

http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/cellcounting.html

5.3. Technical Note - Cell Counting with Neubauer Chamber – Celeromics. Disponível em: http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-articlechamber.php

1. Anexos:

                     Não se aplica.

1. Registros:

Realizar os registros nos locais apropriados.

Anexo I

Fluxograma