A Extração de DNA de um vegetal

Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo[pic 1]

Camila Coelho de Miranda 10700434

Giovana Ferreira Baroni 10759012

Lucia Harumi Nakata 10700413

Relatório 02

Química Geral (QFL0137)

Março 2018

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Resumo

Nesta experiência de laboratório foi realizado um experimento simples de extração de DNA de um tomate utilizando procedimentos laboratoriais de fácil execução. Trata-se de um tema atual muito utilizado em áreas como a biologia molecular e a partir do qual se pode trabalhar uma série de conceitos físico- químicos fundamentais, sendo este o objetivo do experimento.

Os materiais usados nessa extração do material genético foram: balança semi-analitica, um tomate, sais (cloreto de sódio e citrato de sódio), detergente, água aquecida, gelo, equipamento para montagem de sistema de filtração a vácuo, proveta, tubo de ensaio, béquer, conta gotas e etanol gelado.

Essas ferramentas foram empregadas para extração do DNA que envolve, a princípio, três procedimentos essenciais: 1) lise das membranas celulares; 2) remoção de proteínas e outros fragmentos de material do DNA; e 3) precipitação do DNA. Todos esses procedimentos serão desenvolvidos através das propriedades físico-químicas dos materiais utilizados, como as interações do detergente – que possui característica tensoativa – com moléculas lipídicas das membranas celulares, interações covalentes e iônicas e solubilidade do DNA em etanol gelado

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Introdução

O objetivo do experimento foi a abordagem físico-química do processo de extração de DNA, utilizando procedimentos simples. O DNA (ácido desoxirribonucleico) se trata da maior molécula celular, formada, basicamente, a partir da união de nucleotídeos, composta por dupla hélice (Imagem 1) e condensada na maior parte da vida da célula. Tal material genético se encontra no interior do núcleo celular, em seres eucariontes, e é responsável por conter todas as informações genéticas do ser vivo. Se tratando de um experimento envolvendo um vegetal, é interessante compreender a estrutura de uma célula desse grupo. Assim como a animal, a célula vegetal possui um núcleo compartimentado constituído de duas camadas fosfolipídica, além das organelas celulares membranosas (retículos e complexo de golgi) e não membranosa (ribossomo), diferindo principalmente com a presença da parede celular (Imagem 2) celulósica, que confere maior rigidez e estabilidade à célula. A partir desse conceito prévio, tem-se um experimento agindo principalmente sobre as partes celulares que envolvem o DNA (membrana plasmática, membrana nuclear e parede celular), afim de deixa-lo “livre” para ser extraído no fim no processo.

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Imagem 1. Nucleotídeos e dupla hélice.

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Imagem 2. Parede celular e membrana plasmática.

Entretanto, embora facilmente ilustrativo, o experimento é finalizado com uma amostra de DNA impura, que não poderia, por exemplo, ser utilizada em procedimentos laboratoriais de biologia molecular avançados, como PCR – reação em cadeia da polimerase – e clonagens moleculares. Dessa forma, outros procedimentos também são possíveis para a extração do material genético tanto de vegetais, como de células animais, possibilitando resultados mais puros através de um processo de purificação.

Vários autores descrevem problemas no isolamento e purificação de DNA vegetal de boa qualidade, esses problemas são resultantes principalmente do co-isolamento de polissacarídeos, substâncias fenólicas e compostos secundários. Segundo o artigo Extração de DNA de plantas, de Eduardo Romano e Ana Cristina Miranda Brasileiro (EMBRAPA), o método mais utilizado com sucesso para diferentes espécies é o baseado no uso do detergente CTAB. Esse detergente solubiliza as membranas, formando com o DNA um complexo que facilita uma posterior precipitação, além disso, polissacarídeos e ácidos nucléicos possuem solubilidade diferenciada na presença desse detergente. 

Muitos procedimentos listados na literatura utilizam o método com o detergente CTAB, especificando alterações de acordo com o material a ser extraído e a sua finalidade. Outro método possivelmente utilizado é a extração de DNA por meio de núcleos celulares. Essa estratégia é baseada em uma prévia separação dos núcleos dos outros constituintes celulares. Esse procedimento pode resolver o problema de co-isolamento de constituintes indesejáveis, como os polissacarídeos e polifenóis citoplasmáticos. A principal desvantagem deste método é que a extração de núcleos a partir de material congelado é muito ineficiente, além de ser um processo laborioso. As preparações de DNA obtidas por qualquer um desses métodos, podem sofrer uma posterior purificação por centrifugação em gradiente de densidade de CsCl. Essa purificação, apesar de trabalhosa, é eficiente na remoção de RNA, polissacarídeos, proteínas e outros contaminantes da amostra de DNA. Outra estratégia para purificação do DNA isolado é a precipitação com acetato de amônio. Essa estratégia é mais rápida, porém o DNA purificado é de menor qualidade.

Além da extração do material genético referente ao DNA, é possível também realizar a extração do RNA (ácido ribonucleico) (Imagem 3). O RNA é uma molécula intermediária entre o DNA e a proteína, no processo de síntese proteica. É formado por uma cadeia de nucleotídeos, que são formados por um fosfato, um açúcar (ribose) e uma base nitrogenada. Diferentemente do DNA, o RNA possui uma fita simples, o açúcar dos seus nucleotídeos é a ribose e não a desoxirribose e uma de duas bases nitrogenadas é a Uracila, em vez da Timina.

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De acordo como Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento da EMBRAPA (Avaliação de diferentes métodos para extração de RNA total de folhas e raízes de braquiária), os métodos para isolamento de RNA baseiam-se na lise e na desnaturação das células que permitem a liberação dos ácidos nucléicos totais e na presença de inibidores que impedem a ação de ribonucleases – RNase – (AUSUBEL et al., 1998). A presença de RNases estáveis e ativas nos tecidos é a principal dificuldade na extração de RNA, pois fazem com que o RNA (altamente instável) seja rapidamente Imagem 3. RNA.                                     degradado. Sendo assim, a primeira etapa na maioria dos métodos de isolamento de RNA após a pulverização dos tecidos, é a imediata exposição deste material a tampões de extração que apresentam substâncias como o cloreto de lítio, que auxilia a precipitação do RNA, e o isotiocianato de guanidina, que permite a manutenção do RNA intacto nas etapas posteriores da extração por meio da degradação das ribonucleases endógenas .É necessária ainda a adição de clorofórmio ao RNA, que solubiliza os lipídios permitindo a sua remoção. Após a centrifugação, três fases podem ser observadas: uma rósea formada pela presença do fenol; uma interface formada pelo clorofórmio; e DNA e uma fase aquosa, onde está presente o RNA. A precipitação do RNA é feita com um álcool, como por exemplo, o isopropanol. Nesta etapa, observa-se uma nuvem branca contendo o RNA. Após esse procedimento será possível identificar a porção composta pela DNA e outra pelo RNA, e assim será possível extrair o RNA da amostra.