ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO: DIGESTÃO ENZIMÁTICA E ELETROFORESE DE DNA
Por: Suelenpati01 • 27/9/2018 • Trabalho acadêmico • 1.948 Palavras (8 Páginas) • 262 Visualizações
RESUMO
As endonucleases de restrição, também denominadas enzimas de restrição, são as ferramentas básicas da engenharia genética, desempenhando função de clivagem (corte) da molécula de DNA em pontos específicos, em reconhecimento a determinadas sequências de nucleotídeos.
Elas reconhecem uma sequência específica de bases em uma molécula de DNA, e clivam a molécula naquela sequência ou próximo dela. A sequência de reconhecimento é chamada de sítio de restrição. Diferentes enzimas de restrição reconhecem e clivam diferentes sítios de restrição.
Essas enzimas são indispensáveis na análise da estrutura dos cromossomos, no sequenciamento de DNA, no isolamento de genes, na criação de moléculas novas de DNA que podem ser clonadas e em técnicas como RFLP. Uma característica marcante de muitos desses sítios de clivagem é que eles possuem uma dupla simetria rotacional, isto é, a sequência de reconhecimento é palindrômica e os sítios de clivagem são simetricamente posicionados.
Palavra chave: DNA, Enzimas de restrição, Eletroforese
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 3
2. OBJETIVO 5
3. MATERIAIS E MÉTODOS 6
3.1 Materiais 6
3.2 Métodos 6
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES 7
5 CONCLUSÃO 11
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 12
- INTRODUÇÃO
A eletroforese em gel consiste em uma técnica de separação de proteínas e ácidos nucleicos diferentes uns dos outros em um campo elétrico se baseando em seu formato, tamanho e sua carga. Normalmente uma matriz é moldada dentro de uma forma de plástico, nesta forma se coloca um “pente” onde com a solidificação do liquido forma poços que serão reservatórios de amostras biológicas. Estes poços ficam do lado onde eletrodo negativo fica do outro lado fica um eletrodo de carga positiva, uma vez que sabemos que o DNA tem carga negativa será atraído para o outro lado da bandeja (TAVARES, 1995). Para a formação de gel temos os dois materiais mais utilizados que são a agarose e poliacrilamida. A agarose tem uma malha entre suas moléculas mais grossas assim deixando, “pedaços” de DNA maiores passarem, já a poliacrilamida tem uma malha entre as moléculas menos espessas selecionando menores pedaços de DNA, isso faz com que este material seja mais sensível para detecção de DNAs com tamanhos próximos uns dos outros, porém uma amostra com tamanhos maiores de DNA seria retido fazendo com que o experimento não seja realizado com sucesso. É importante ressaltar que nenhuma das substâncias interagem com as proteínas e os ácidos nucleicos fazendo assim que estes passem sem nenhuma alteração. (SANDERS, 2014)
Com o tempo pedaços menores de DNA serão mais deslocados que os maiores, mostrando assim uma linha até onde cada um se deslocou. Isto mostra o polimorfismo do DNA uma vez que percebemos tamanhos de fragmentos diferentes porque a enzima de restrição não conseguiu cortar no sitio já que provavelmente ocorreu uma mutação nesse genoma. (CARVALHO, 2015)
É extremamente importante ter alguns cuidados no momento da técnica. Como por exemplo não inverter os polos das cargas regular o aparelho para o tamanho da bandeja o tipo de material utilizado, utilização da concentração de agarose ou poliacrilamida já que isso influência no tamanho da malha e a amperagem do aparelho, já que em amperagens maiores a força de atração será maior alterando a passagem de fragmentos pelo gel (BRUNO, 2014)
As enzimas são tipo de proteínas capazes de acelerar uma reação química a maior parte das reações metabólicas ocorrentes nas células é realizada com a ajuda de enzimas especificas. Elas também podem conter várias funções como a capacidade de aumentar ou diminuir o tamanho de moléculas. As polimerases atuam na formação de novas moléculas de DNA no momento da replicação ou no RNA na síntese de proteínas já as enzimas que cortam o DNA são as endonucleases também conhecidas como enzimas de restrição. Elas têm o principal objetivo clivar uma sequência de DNA na região determinada, existem várias enzimas de restrição que poderá ser escolhida pelo fim no qual se precisa no experimento, cada enzima cliva em uma determinada parte do DNA e será escolhida onde o pesquisador tem suspeita de polimorfismo (PIMENTA – 2015).
Um método eficaz e de análise rápida é o de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição ou em inglês restriction fragment length polymorphism o RFLP. Neste método o gene alvo geralmente de RNAr é amplificado pela técnica de PCR a partir de do DNA usando iniciadores (primers), no qual um dos iniciadores tem sua extremidade marcada com um corante florescente e então tratados com enzimas de restrição que vão cortar o DNA nas sequencias determinadas com a amplificação do DNA é possível enxergar o polimorfismo através do tamanho dos fragmentos utilizando a eletroforese (MADIGAN, 2016).
- OBJETIVO
Realizar a digestão enzimática, simples e dupla, e montar um mapa de restrição de um DNA plasmidial a partir de dados obtidos após a eletroforese em gel de agarose.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
Materiais e Equipamentos:
Banho Maria, Pipetas, Tubos de 200µL
Reagentes e Soluções:
Foi usado q.w.p. 20 µL de água Mili-Q ®, 5 µL de corante 50%, 5 µL de DNA. Para Digestão simples foi usado 1 µL da enzima BamHI com 2 µL do tampão da BamHI, e para digestão dupla foram usadas 1 µL das enzimas BamHI e HindIII com 2 µL do tampão da BamHI
3.2 Métodos
Digestão Simples:
Com o auxílio da Pipeta, pipetou-se dentro de um tubo com o DNA, 2 µL de tampão da enzima BamHI, 1 µL da enzima BamHI e q.w.p. 20 µL de água Mili-Q ®. Após homogeneizado, foi levado ao banho-maria a 37º C por 30 minutos.
Digestão Dupla:
Com o auxílio da Pipeta, pipetou-se dentro de um tubo com o DNA, 2 µL de tampão da enzima BamHI , 1 µL da enzima HindIII e 1 µL da enzima BamHI e q.w.p. 20 µL de água Mili-Q ®. Após homogeneizado, foi levado ao banho-maria a 37º C por 30 minutos.
Após passados o tempo das amostras no banho-maria, as mesmas foram coradas e aplicadas no gel de agarose para que fosse feito o procedimento da eletroforese.
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