Tcc condições fisiológicas, normais ou patológicas

RESUMO

O estudo de diferentes condições fisiológicas, normais ou patológicas, em tecidos mineralizados tem ganhodestaque nos últimos anos, devido, principalmente,ao aumento da expectativa de vida. Neste contexto, doenças como a osteoporose, têm despertado maior interesse em diferentes grupos de pesquisa.Nosso grupo tem trabalhado com mecanismos de transdução de sinais envolvidos com a diferenciação de osteoblastos e verificamos que a modulação da atividade de Src pela LMWPTP (Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase) é uma condição necessária para este evento. Neste caso, durante a diferenciação osteoblástica, Src encontrava-se inibida (desfosforilada no resíduo Y416). Baseado nestes achados, aventamos a hipótese de que inibição exógena de Src estimularia a diferenciação dos osteoblastos. Decidimos verificar se a inibição exógena de Src poderia estimular a diferenciação destas células. Desta maneira, tratamos pré-osteoblastos (MC3T3-E1) com 2 moléculas (Gleevec e PP1) conhecidamente capazes de modular negativamente a atividade de Src.Inicialmente, estabelecemos uma curva dose-resposta, avaliando seu efeito citotóxico, afim de escolhermos uma concentração subtóxica. Nossos resultados mostraram que, em baixas concentrações,ambos inibidores de Srcforam capazes de estimular a diferenciação de osteoblastos, aqui verificada pela atividadede fosfatase alcalina, um clássico biomarcador desteprocesso. Para validar nossa hipótese, decidimos verificar se, de fato, estes inibidores foram capazes de promover a desfosforilação de Src, através de western blotting. Nosso resultados mostraram que, de fato, ambos inibidores promoveram uma diminuição no perfil de fosforilação de Src no resíduo Y416 (fosforilação que garante a atividade de Src), sugerindo queo processo de diferenciação celular estimulado por estes inibidores culminava a partir da inativação de Src. Outro resultado importante, obtido neste estudo, foi verificar a atividade de LMWPTP na presença dos inibidores em questão. Surpreendentemente, mostramos que Gleevec interfere na atividade desta enzima in vitro, gerando uma maior atividade, enquanto que PP1 não altera sua atividade. Baseados nestes resultados, mostramos que inibidores de Src são potenciais estratégias para diferenciação de osteoblastos, abrindo uma nova linha de raciocínio para que novos experimentos sejam realizados a fim de verificar sua eficiência sistêmica em animais acometidos com osteoporose.

Palavras-chave:osteoporose; Src; diferenciação de osteoblastos; Gleevec; PP1; LMWPTP

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ABSTRACT

To know molecular aspects of mineralized tissues is an interesting strategy to identifying pharmacological targets regarding pathologicalconditions of bone. In this context, different researchgroups have investigated bone metabolism in order to know how bone cells interact with the system. In this way, our group has been working with signal transduction involved with the osteoblasts metabolism, specially their differentiation. Recently, we have shown that Src’s  activity modulation through LMWPTP (Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase) is a necessary condition for osteoblast differentiation and we suppose this is interesting to be explored focusingon osteoporosis treatment. Based on these findings, we suggest the hypothesis that the exogenous inhibition of Src would stimulate the osteoblasts differentiation. Thus, we treated pre-osteoblasts (MC3T3-E1) with two inhibitory molecules of Src (Gleevec and PP1). Initially, we established a dosage-response curve of both evaluated drugs in order to verify their cytotoxic effects and determine some sub-toxic concentration of them. By using low concentration both Src inhibitory molecules were able to stimulate osteoblast differentiation, here assayed by the alkaline phosphatase activity, a classic biomarker of this process. Thereafter, we decided to verify the effect of both Src inhibitors on Src phosphorylation by performing western blotting approach.Here,our results showed thatbothtested inhibitors were capable of modulating negativelySrc by interfering on Src phosphorylation at Y416 residue (phosphorylation that guarantees Src activity), suggesting that the cellular differentiation process stimulated by bothinhibitors culminated from the Src inactivation. Another important result obtained in this study, was to verify the LMWPTP activity in the presence of both drugs. Surprisingly, we showed that Gleevec interferes positively on LMWPTP activity, while PP1 does not change its activity. Based on these results, we concluded that Src inhibitors are potential strategies for osteoblasts differentiation, opening a new avenue of investigationfor identifying their performance in vivo.

Key words: osteoporosis; Src; osteoblasts differentiation; Gleevec; PP1; LMWPTP

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LISTA DE ABREVIATURAS

DTT –Ditiotreitol

Gleevec – Inibidor inespecífico de Src

LMWPTP – Proteína Tirosina Fosfatase de Baixo Peso Molecular

MC3T3-E1 – Linhagem celular de pré-osteoblastos

MEC – Matriz Extracelular

αMEM – Meio mínimo essencial

MTT – Brometo de [3-metil-(4-5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazólio]

PBS – Tampão Fosfato Salino

PK – Proteína Quinase

PP – Proteína Fosfatase

PP1 – Inibidor específico de Src

PTP – Proteína Tirosina Fosfatase

SDS -Dodecil Sulfato de Sódio

SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio

SFB – Soro Fetal Bovino

Src – Proteína tirosina quinase

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SUMÁRIO

1.        INTRODUÇÃO        

1.1.        Osteoporose        

1.2.        Osteoblastos        

1.3.        Proteínas Tirosina Fosfatase (PTPs) e Quinase (PTKs)        

1.4.        Modulação da atividade de Src e seu papel na biologia óssea        

1.        DESENVOLVIMENTO DO TEMA        

2.        OBJETIVOS        

3.        MATERIAIS E MÉTODOS        

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