A Biotecnologia da Saúde

1ª prova Biotecnologia aplicada à saúde

1. CONCEITOS

• Reação em cadeia da polimerase: amplificação de DNA in vitro;
• Eletroforese em gel: separar moléculas em gel sob ddp por seu tamanho;
• Sonda: DNA ou RNA marcado radioativamente p/ identificar sequências complementares por hibridização;
• Hibridização: pareamento complementar de bases entre fitas simples, gerando dupla;
• Southern Blot: transferência de moléculas de DNA de gel de eletroforese p/ membranas de nylon ou nitrocelulose, faz-se hibridização c/ sondas marcadas p/ localizar sequências especificas de DNA. Pode detectar fragmentos em mistura complexa produzida pela clivagem de DNA c/ enzima de restrição;
• Norther Blot: RNA’s separados por eletroforeses, transferido p/ membrana de nitrocelulose, exposto a sonda marcada e complementar ao gene de interesse;
• Wester Blotting: imunodetecção de proteínas após separação destas por eletroforese em gel e transferência p/ me adsorvente;
• Endonuclease de restrição: enzimas clivam DNA onde há sequência pequena especifica de nucleotídeos;
• cDNA: molécula de DNA formada a partir/complementar a um mRNA, não tem introns.
• Vetores: molécula de DNA onde fragmento de DNA a ser clonado esta ligado. EX plasmideos, cosmideos etc.
• Bibliotecas de DNA: coleções de fragmentos de DNA obtidos por endonucleases e clonados por vetores. É biblioteca genômica se possui totalidade do genoma de um organismo ou biblioteca de DNA complementar se inclui apenas moldes de cDNA obtidos por transcriptase reversa.
• DNA microarray (DNA chip): arranjo pré definido de moléculas de DNA quimicamente ligados a microchip que permite analise de sequências alvo por hibridização;
• Primers: oligonucleotideos de DNA ou RNA utilizados p/ síntese de DNA pela DNA polimerase;
• Marcadores moleculares: marcadores genéticos que revelam polimorfismo entre indivíduos relacionados geneticamente, por exemplo:

• Microssatelite/STR: sequências curtas de DNA repetidas em tandem, obtidos por primers a partir de PCR;
• Minissatelite/VTNR: sequência de DNA de 10-100 pb repetidos em tandem, sendo este numero variável. Repetições hipervariaveis estão distribuídas pelo genoma;
• RAPD: fragmentos de DNA amplificados por PCR utilizando primers curtos de sequências aleatórias;
• RFLP: fragmentos de DNA obtidos por endonucleases e separados por eletroforese, visualizados por hibridização;
• SNP: marcador molecular utilizado p/ identificar mutações e polimorfismos de único nucleotídeo, necessitando de informações de sequênciamento do DNA p/ desenho de primers e sondas.

• Benefícios da biotecnologia (utilização de processos biológicos p/ agregar valor a produto): produção de antibióticos, vacinas, macromoleculas úteis na medicina, diagnostico molecular de doenças. Ferramentas moleculares utilizadas diagnostico e áreas da biotecnologia podem ter origem na genomica (estuda estrutura básica dos genomas), transcriptomica (estuda genes em determinado tempo, local ou condição celular) e proteomica (avalia estrutura e função de proteínas resultantes de expressão gênica).

1. DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS

• Princípios de diagnóstico molecular de doenças: efetividade do diagnóstico em qualquer situação depende da reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade.

• Reprodutibilidade: diagnostico deve ser sempre repetido da mesma maneira em diferentes situações;
• Especificidade: mede capacidade do teste em excluir corretamente os que não possuem a doença (quão especifico é o teste);
• Sensibilidade: mede capacidade do teste em identificar corretamente quem possui a doença (quão sensível é o teste).

• Padrão de herança de doenças genéticas: simples ou complexa

• Autossômica recessiva: genes presentes nos autossomos de indivíduos afetados tem 2 cópias do gene mutante (2 alelos);
• Autossômica dominante: genes nos autossomos, basta uma cópia do mutado para causar doença (1 alelo);
• Ligadas ao cromossomo X: genes agem como mutações dominantes principalmente no sexo masculino.
• Poligênicas/multifatoriais: mais de um gene tem mutação resultante de fatores genéticos e epigenéticos (ambientais), é herança complexa.

• Fibrose cística (FC): é doença genética hereditária, autossômica recessiva no cromossomo 7 que contem gene CF codificante p/ proteína CFTR, presente em membranas celulares de vias respiratórias, pâncreas, glândulas sudoríparas, intestino etc, controlando fluxo de sais (principalmente cloro) e água que passam pela célula.  Há diferentes mutações para essa doença e cada mutação difere quanto ao nível em que afeta a proteína CFTR, algumas mutações diminuem seu numero, outras fazem com que ela funcione incorretamente. Se transporte de íons é parcialmente afetado, doença é mais leve, mas quando cloro é totalmente obstruído, quadro é grave. Mutação ΔF508 é mais freqüente, eliminando fenilalanina desta posição.

Como sintomas tem-se suor salgado, já que cloro nem sódio são captados (transporte conjunto), pólipos nasais, infecção, sinusite, nariz entupido, dor de cabeça, muco nos ductos pancreáticos, infertilidade ou diminuição da mesma, etc.

O diagnostico da FC pode ser feita por tripsina imunorreativa no sangue (teste do pezinho), cloro no suor, ou analise molecular.

Inicialmente faz-se PCR, que amplifica DNA na região da mutação, não diferenciando homo de heterozigotos. Depois uma eletroforese, que é passada p/ membrana especial e faz-se souther blot, onde hibridiza-se DNA c/ sonda p/ alelo normal e p/ alelo mutado. Apenas heterozigoto faz anelamento, podendo diferenciá-los.

• Doença de Huntington (DH): é doença hereditária, autossômica dominante, neurodegenerativa, afetando sistema nervoso central geralmente a partir dos 30 anos.

Gene (huntingtin) no cromossomo 4 está alterado por conter muitas repetições (42 a 100 ou mais) da trinca CAG, tornando região da proteína poliglutaminica e aumentando interações proteína-proteina, acumulando proteína huntingtina em células encefálicas, sendo esta a provável causa dos sintomas clínicos da DH. Quanto maior o nº de repetições, mais cedo DH desenvolve e mais grave é.

Estes sintomas são dificuldade p/ falar e engolir alimentos, memória de curto prazo e concentração diminuem, irritabilidade, apatia, instabilidade emocional, agressividade, depressão etc.

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