AVALIAÇÃO RELATÓRIO PELO DO DOCENTE

A Clonagem gênica é uma de técnica da biologia molecular envolvendo  DNA recombinante, consiste na inserção de um segmento de DNA em um plasmídio e em seguida é introduzido em bacterias atravez do processo d transformação, estes atuam como vetores de clonagem, e consequentemente na replicação deste DNA em um hospedeiro apropriado, como, por exemplo, uma bactéria ou uma célula de levedura. As bacterias são selecionadas utilizando antibióticos. Essa replicação ocorre a partir de quando o DNA é inserido em uma célula especifica. Com isso, uma dessas células transformadas são obtidas, a partir da divisão celular, um número incontavel de células idênticas, cada uma contendo várias cópias do DNA recombinante. Em determiados casos, precisamos de muitas cópias de DNA para realizar experimentos ou construir novos plasmídeos.

        As técnicas de genética modificam certas células, para exprimir ou alterar genes clonados. Essa tecnologia tem levado a produção de várias proteínas de interesse, tanto comercial quanto médico, como, por exemplo: fatores de coagulação sanguínea, antitrombina, albumina sérica, hormônio de crescimento,  interleucinas e insulina.

        Podem ser obtidas, também, proteínas que servirão para a produção futura de vacinas. Assim, a produção de determinadas vacinas contra vírus, representando uma esperança para o controle de determinadas doenças a longo prazo.

2.1 Objetivo geral

        Conhecer os principios basicos da técnica de DNA recombinante. Sabendo como obter um alto número de cópias de um fragmento génico de interesse, que pode ser aplicado em diversas areas da manipulação gênica. Utilizando a forma in vitro,  e realizando todo o procedimento requerido em material de laboratório.

2.2 Objetivo específico

O objetivo deste procedimento foi realizar uma clonagem bacteriana, através do processo de transformação genética usando o princípio de choque térmico, mostrando sua eficiência.

3.1 MATERIAL.

        Alça de Drigalski

        Agitador

        Bacteria Competente DH5alfa

        Banho térmico (42°C)

        Bico de Bunsen

        Banho gelado

        Meio de Cultura LB

        Micropipetadores

        Microcentrifuga

        Ponteiras

        Placa de Petri com meio LB / ágar

3.2 MÉTODOS

Pegou-se 100 microlitros de bactérias competentes e inoculou no tubo;

Homogeneizou-se os tubos por inversão;

Adicionou-se 10 microlitros da reação de ligação ás bactérias competentes, mantendo em banho de gelo;

Homogeneizou-se novamente os tubos por inversão;

Incubou-se o tubo em banho de gelo por cerca de 20 minutos;

Submeteu-se as células ao choque térmico retirando rapidamente o micro tubo contendo as bactérias competentes do gelo e colocou-se por 2 minutos no banho-maria a 42°C.

Incubou-se no gelo por 2 minutos;

Adicionou-se 500 microlitros de meio de cultura LB, dividiu-se em dois tubos e adicionou 500 microlitros de caldo TSB em cada tubo.

Incubou-se a 37°C durante 30 minutos em banho maria;

Homogeneizou-se a solução;

Semeou-se 100 microlitros no meio LB contendo ampicilina

Incubou-se por 18 horas na estufa a 37°C de microbiologia e estocou as placas a 4°C.

É possível obter através de transformações bacteriana por choque térmico a viabilidade das células capaz por via dos resultados obtidos incubados em meio de cultivo (Lúria-Bertani [LB]) é um procedimento viabilizado para o cultivo e manutenção de cepas recombinantes tanto para a recuperação das células, para analisar a eficiência da técnica de choque térmico foi obtido um conjunto de clonagem contendo entre várias características os possíveis genes de resistência à ampicilina (Ampr), após o processo de choque térmico quanto para a implementação dos possíveis clones (na forma sólida) suplementado com o antibiótico ampicilina, fazendo com que o gene clonado sejam aqueles que foram resistentes ao antibiótico do meio de cultivo.

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