ELECTROFORESE DE PROTEÍNA: O PRINCÍPIO DA METODICA

ELETROFORESE DE PROTEINAS : PRINCIPIO DA TÉCNICA

A eletroforese é uma técnica analítica utilizada na análise de macromoléculas como proteínas e ácidos nucléicos. Essa técnica foi descoberta e empregada pela primeira vez em 1937 por Arne Tisélius um bioquímico sueco. O efeito eletroforético tem como base a teoria de Debye-Hückel-Onsager, onde esta teoria de dissociação eletrolítica aceita o fato de as partículas carregadas moverem-se sob a influência de forças eletrostáticas para um eletrodo de carga oposta quando é aplicada umadiferença de potencial em uma solução contendo eletrólitos.

A eletroforese é a migração de uma molécula carregada sob a influência de um campo elétrico. A mobilidade eletroforética é dada por:

μ= v/E = Z/f

Onde:

A mobilidade eletroforética (μ) é a razão entre a velocidade(v) da macromolécula e o potencial elétrico(E) que move a macromolécula ou a razão entre a carga líquida(Z) e o coeficiente de atrito(f).

Suportes para eletroforese

Os suportes para eletroforese comumente empregados são os géis de poliacrilamida para proteínas e agarose para os ácidos nucléicos, em virtude de estes polímeros funcionarem como uma peneira molecular, ou seja, separar as espécies em função de sua massa e tamanho molecular, respectivamente, inibe a propagação do calor em virtude do atrito causado pela migração e pela aplicação do campo elétrico.

Os géis de poliacrilamida são comumente utilizados na separação de proteínas em virtude de ser quimicamente inertes, facilidade de coloração com nitrato de prata e corante azul de Coomassie(corantes como esses coram totalmente a agarose impossibilitando a identificação das espécies no eletroforetograma), os poros são facilemente ajustáveis através do controle de acrilamida e bis-acrilamida que são os polímeros que formam o gel.

Os géis de agarose são utilizados para macmoléculas com massa molecular a superior a 200 kD visto que os ácidos nucléicos apresentam massas moleculares extremamente grande. A coloração do eletroforetograma de ácidos nucléicos é realizada como brometo de etídio, em fução dos outros corantes provocarem a coração total do gel de agrose impossibilitando a identificação dos ácidos nucléicos.

Eletroforese de macromoléculas em Gel de SDS

A amostra de interesse deve ser preparada com o rompimento da matriz em que encontra-se o composto de interesse, nesse caso é uma célula que é rompida por métodos, físicos ou químicos onde os métodos físicos incluem destruição mecânica ou maceração e métodos químicos funcionam através do rompimento por meio da adição de compostos químicos que não afetem as características físico-químicas, do composto de interesse.

Após a essa preparação a amostra é colocada em uma solução chamada de tampão de amostra que contém em sua composição agentes químicos redutores, desnaturantes e tamponantes. Em seguida essa solução é aquecida a 90ºC por um períodos de 5 a 10 minutos para desnaturação da macromolécula. Um exemplo desses agentes são:

SDS ou dodecilsulfato de