O Processamento Histopatologico

Biópsias: coleta e envio de amostras para exame histopatológico

A biópsia é um procedimento cirúrgico efetuado no paciente vivo, visando à coleta de amostras de tecido ou de células para análise microscópica. A biópsia possui grande importância no diagnóstico de lesões cutâneas e de outros tecidos e órgãos internos, em casos de suspeita de neoplasias, quadros inflamatórios e degenerativos. Além do diagnóstico de lesões, o exame histopatológico também pode auxiliar na avaliação de margens cirúrgicas de neoplasias, na severidade de doenças inflamatórias ou degenerativas e na detecção de agentes infecciosos.

1. Coleta de amostras por biópsia

a) Lesões cutâneas e subcutâneas

A coleta de amostras de lesões de pele para exame histopatológico pode variar de acordo com a lesão em si e também com a suspeita do veterinário. Dependendo do tamanho e do local da lesão, do número de amostras e da própria índole do animal, o veterinário poderá optar pela anestesia local, sedação ou anestesia geral.

Neoplasia é o termo que designa alterações celulares que acarretam um crescimento exagerado destas células, ou seja, proliferação celular anormal, sem controle e autônoma, na qual reduzem ou perdem a capacidade de se diferenciar, em consequência de mudanças nos genes que regulam o crescimento e a diferenciação celulares. A neoplasia pode ser maligna ou benigna. 

No caso das lesões neoplásicas, a avaliação da formação determinará o melhor método para sua amostragem e posterior análise histopatológica. A avaliação da formação inclui suas dimensões, a análise do local e da aderência da massa a tecidos adjacentes e também o possível envolvimento de linfonodos regionais¹. A citologia aspirativa de formações cutâneas antes de sua remoção cirúrgica pode ser útil como forma de exame de triagem para estabelecimento do próximo passo a ser seguido. A citologia, que será abordada em um artigo futuro, permite a rápida diferenciação entre processos inflamatórios e neoplásicos, além de poder fornecer informações quanto às células de origem e aos sinais de malignidade de um processo neoplásico. 

A biópsia de neoformações pode ser excisional ou incisional. No primeiro caso, a formação é removida em sua totalidade, de preferência com margens cirúrgicas amplas, quando possível (Figura 1). Realizadas atraves de anestecia local. Riscos desse procedimento: Cicatriz definitiva, sangramentos e menos frequente a infecção , O exame patologico ficara pronto em 5 a 14 dias.

Já a biópsia incisional é geralmente realizada em neoplasias que apresentam grandes dimensões ou dificuldade de remoção total, sendo retiradas pequenas amostras representativas que permitam o diagnóstico histopatológico. Nesses casos, recomenda-se que sejam amostradas diferentes regiões da lesão, de preferência que não apresentem extensas áreas de necrose ou ulceração, uma vez que estas podem dificultar o diagnóstico, principalmente em amostras pequenas. 

Figura   1. Margens cirúrgicas em biópsias cutâneas excisionais.

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Legenda: (N) nódulo. Números 1 a 4: margens laterais. Número 5: margem profunda.

Para lesões pustulares ou vesiculares, recomenda-se a amostragem da pústula ou da vesícula íntegras em sua totalidade, evitando-se as lesões mais antigas, que já se mostrem ulceradas. A análise da pústula ou vesícula íntegra é essencial para o diagnóstico de doenças autoimunes, como o pênfigo, que pode ser impossibilitada pela ausência do epitélio nas lesões ulceradas. Sugere-se cautela inclusive no momento da antissepsia, para que não haja rompimento das lesões mais delicadas. Caso as lesões sejam predominantemente ulcerativas, recomenda-se a amostragem da úlcera com uma margem de epitélio íntegro para a análise. As regiões eritematosas recentes, ainda não ulceradas, também costumam oferecer bom potencial diagnóstico. As lesões emtecido subcutâneo podem ser amostradas com margens cirúrgicas, no caso das neoplasias, atentando-se para a margem profunda, que preferencialmente deve apresentar no mínimo o mesmo tamanho das margens laterais, quando possível (Figura 1). 

As biópsias de pele são comumente realizadas com o uso de bisturi, de agulhas grossas (Figura 2) ou do punch (Figura 3). O punch é uma ferramenta frequentemente utilizada em lesões cutâneas inflamatórias, degenerativas ou em neoplasias, tanto como biópsia incisional quanto na excisão de pequenos nódulos benignos. Dentre as vantagens do uso do punch estão a facilidade e a rapidez da técnica, que geralmente requer apenas um ou dois pontos cirúrgicos, dependendo do diâmetro do punch e do local da lesão. Dentre as desvantagens, a amostragem da lesão pode ser insuficiente para o diagnóstico histopatológico, principalmente quando são utilizados punches com diâmetro muito pequeno. Para a coleta de amostras de lesões cutâneas, recomenda-se o uso do punch com diâmetro mínimo de 0,5 cm e, de preferência, com amostragem de diferentes lesões ou de regiões distintas de uma mesma lesão. Para essa técnica, não é recomendada a amostragem da lesão com margens de tecido íntegro, pois o tamanho pequeno da amostra pode resultar na amostragem apenas da região sadia, prejudicando o diagnóstico. 

Figura 2. Biópsia por agulha grossa.

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Legenda: A. Após a incisão da pele com bisturi, a agulha é inserida no nódulo. B. A cânula externa é fixada no local de amostragem, e a cânula interna penetra no tumor, obtendo uma amostra do tecido. C. A cânula interna é fixada, enquanto a cânula externa é movida para frente, cortando o tecido amostrado. D. O instrumento inteiro é removido fechado, contendo a amostra. E. A cânula interna é pressionada para a frente, expondo o tecido amostrado em forma de um pequeno cilindro. Fonte: “Withrow & MacEwen’s Small Animal Oncology”, 4th Ed., Elsevier, 2007².

Figura 3. Biópsia por punch.

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Legenda: A. O punch é rotacionado no local da lesão, até que a profundidade desejada seja obtida. B. O punch é removido. C. A amostra é tracionada delicadamente com a pinça e seccionada na profundidade. Fonte: “Withrow & MacEwen’s Small Animal Oncology”, 4th Ed., Elsevier, 2007².

Não é recomendado o uso de eletrocautério ou de lasers cirúrgicos em biópsias, pois tendem a deformar a arquitetura celular. O eletrocautério pode ser utilizado apenas para a hemostasia após a remoção da amostra². 

b) Lesões em tecidos e órgãos internos

As lesões em tecidos e órgãos internos podem ser amostradas por diferentes métodos, como endoscopia, laparotomia, toracoscopia ou com o uso de agulhas grossas guiadas por ultrassom. A amostragem de diferentes áreas da lesão e da zona de transição com o tecido íntegro, quando possível, também é recomendada nestes casos. 

Nas biópsias do trato gastrointestinal, da vesícula urinária, da vagina e do útero, além das mucosas nasal e oral, recomenda-se a amostragem não só do epitélio superficial/mucosa, mas também da submucosa e, se possível, da camada muscular, uma vez que as lesões principais ou primárias podem estar localizadas nas camadas mais profundas do órgão ou tecido. Além disso, a amostragem de camadas profundas permite melhor avaliação do grau de invasão de células neoplásicas malignas.

Em biópsias que amostrem diferentes segmentos intestinais (duodeno, jejuno, colón etc.), recomenda-se que as amostras de cada segmento sejam enviadas separadas e identificadas, uma vez que as lesões neoplásicas ou inflamatórias muito severas podem alterar seriamente a arquitetura tecidual, prejudicando a diferenciação entre os segmentos pela sua histologia normal.

2. Envio de amostras para exame histopatológico

As amostras obtidas por biópsia devem ser manipuladas com o mínimo de tração possível, para evitar deformações nas fibras colágenas do tecido. Para tanto, recomenda-se restringir o uso da pinça apenas às regiões que não fazem parte da lesão em si, evitando-se a formação de artefatos. Amostras de pele podem se enrolar ou dobrar ao serem removidas, por isso é recomendado o posicionamento do tecido sobre um pedaço de papel cartão ou semelhante antes da fixação, com o tecido subcutâneo aderido à superfície do papel, para que se conserve esticado. 

a) Fixação da amostra

As amostras devem ser fixadas imediatamente em solução de formol a 10%, a qual é amplamente utilizada para a maior parte dos tecidos amostrados, podendo ser obtida pela formulação a seguir: 

Solução de formol 10% tamponado:
- 1 parte de formaldeído comercial (37% ou 40%) 
- 9 partes de água destilada 
- Fosfato de sódio monobásico (4,0 g para cada litro de solução)
- Fosfato de sódio dibásico (6,5 g para cada litro de solução)

Solução de formol 10% não tamponado:
- 1 parte de formaldeído comercial (37% ou 40%)
- 9 partes de água da torneira

A solução de formol não tamponado pode ser utilizada na ausência da solução tamponada, mas costuma gerar artefatos na forma de pigmentos intracelulares acastanhados, que não devem ser confundidos com distúrbios pigmentares.

Para a correta fixação das amostras, recomenda-se um volume de formol 10 vezes maior que o volume da peça. O tempo de fixação dependerá do tamanho da amostra. O formol penetra por volta de 1 mm de tecido por hora; assim, amostras menores são preferíveis, evitando que haja autólise do tecido antes que a fixação possa ocorrer. A fixação deve ser feita preferencialmente em temperatura ambiente, uma vez que altas temperaturas favorecem a autólise e baixas temperaturas reduzem a velocidade de fixação.

Devem ser utilizados frascos de boca larga e bem vedados, principalmente se o material for enviado a outro local para processamento. Os coletores universais são frequentemente utilizados para este fim, porém o tamanho do frasco deve ser condizente com o volume da amostra e do formol, para evitar a deformação de peças grandes. Amostras ou peças cirúrgicas grandes podem ser acondicionadas com o volume adequado de formol em sacos plásticos resistentes, tomando-se cuidado para que não haja a possibilidade de vazamentos ou rasgos.

As amostras não devem ser congeladas ou acondicionadas em outras soluções que não o formol, a menos que especificadas pelo patologista ou laboratório responsável pela análise histopatológica, a fim de se evitar artefatos ou problemas de processamento.

Amostras congeladas apresentam destruição das células no descongelamento, prejudicando a avaliação histopatológica³. Amostras provenientes de biópsia somente são congeladas para avaliação de gordura no tecido ou nas análises transoperatórias pelo método do criostato, que proporciona congelamento rápido e menor destruição das células. Dessa forma, para exames histopatológicos de rotina, que fornecem melhores informações para o diagnóstico definitivo, as amostras nunca devem ser congeladas. 

O acondicionamento de amostras em outros líquidos diversos, como o soro fisiológico ou o álcool etílico, dentre outros, também não é recomendado. O soro fisiológico não preserva o tecido, o qual sofrerá autólise e putrefação, mesmo se mantido refrigerado. O álcool, por sua vez, precipita as proteínas e desidrata o tecido, deixando-o rígido e provocando artefatos. O álcool etílico 70˚ pode ser utilizado apenas em situações de emergência até a transferência da amostra para a solução de formol, a qual deve ser a mais rápida possível. Nesses casos, o local responsável pelo processamento da amostra para exame histopatológico deve ser avisado de que a amostra segue em qualquer outro meio que não o formol, para que as devidas providências sejam tomadas.

Amostras que apresentem potencial para a realização de exame imunohistoquímico (IHQ) não devem permanecer por longos períodos na solução de formol. Na IHQ, a ligação de diversos anticorpos pode ser prejudicada pela fixação prolongada em formol. Após a fixação da amostra em sua totalidade, esta pode ser transferida, se necessário, para o álcool 70˚ até o processamento.

b) Identificação de margens cirúrgicas

Para a avaliação correta de margens cirúrgicas, recomenda-se que seus limites sejam marcados com tinta nanquim ou similar, e que sejam identificadas individualmente através de um padrão de fios de sutura, como exemplificado na Figura 4, e que este padrão seja informado ao patologista. Caso a peça seja muito grande e não possa ser enviada inteira, as margens podem ser enviadas separadamente, contanto que devidamente identificadas, sendo de responsabilidade do veterinário clínico ou cirurgião que a marcação ou identificação corresponda à margem real da lesão.

Figura 4. Exemplo de identificação de margens cirúrgicas com fios de sutura.

[pic 4]
Legenda: A identificação de cada margem cirúrgica na amostra é feita pelo veterinário clínico ou cirurgião, que deve informar ao veterinário patologista a qual margem cirúrgica cada marcação corresponde, conforme exemplificado no quadro azul.

c) Informações importantes a serem encaminhadas junto com a amostra

A amostra deve ser enviada identificada com o nome ou o número do animal, espécie, raça, sexo e idade. Além disso, deve estar acompanhada da ficha de solicitação do exame devidamente preenchida, contendo a descrição da lesão, sua localização, histórico e suspeita clínica, além do tipo de biópsia realizada (excisional ou incisional, punch, agulha grossa etc). Também são relevantes as informações quanto a exames anteriores ou complementares, como citologia aspirativa, ultrassonografia ou radiografia, além de lesões semelhantes prévias, acometimento de linfonodos regionais ou de ossos, dentre outras. No caso das neoplasias, se for realizado protocolo quimioterápico prévio, este também deve ser informado.

Considerações finais

A biópsia é uma técnica de extrema importância no diagnóstico de lesões teciduais, sejam estas de origem neoplásica, inflamatória ou degenerativa, além de permitir a identificação de determinados agentes infecciosos, a avaliação de margens cirúrgicas, a graduação e o prognóstico de neoplasias. Existem diferentes métodos de se realizar uma biópsia, sendo cada técnica mais ou menos adequada para cada situação. Se houver dúvidas quanto ao melhor procedimento a ser realizado em determinada situação, desde o tipo de biópsia, o número de amostras e até o método de fixação, não hesite em contatar o laboratório ou o patologista responsável pela análise histopatológica. O diálogo entre o patologista e o clínico ou cirurgião propicia uma rica troca de informações entre as especialidades, permitindo a obtenção de diagnósticos mais precisos e completos, auxiliando na tomada de decisões e favorecendo o tratamento do paciente.

Referências bibliográficas

1. CULLEN, J.M.; PAGE, R.; MISDORP, W. An overview of cancer pathogenesis, diagnosis, and management. IN: MEUTEN, D.J. Tumors in Domestic Animals. 4th Ed., Ames: Blackwell, 2002. p. 3-44.

2. EHRHART, N.P.; WITHROW, S.J. Biopsy principles. IN: Withrow & MacEwen’s Small Animal Oncology. 4th Ed., St. Louis: Elsevier, 2007. p.147-156.

3. MYERS, R. K. ; McGAVIN, M. D. Respostas celulares e teciduais à lesão. In: McGAVIN, M. D. ; ZACHARY, J. F. Bases da Patologia em Veterinária. 4. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2009. p. 3-62.

 

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