Os Processos Fermentativos

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Isolamento, identificação e rastreio de bactérias probióticas potenciais no leite de cabras Saanen da África do Sul

Resumo Este estudo visava avaliar as bactérias lácticas isoladas do leite de cabras Saanen para atributos probióticos, determinando o seu potencial como microbianos alimentados directamente para cabras. Os isolados foram identificados utilizando o sistema API 50CH, 16S rDNA sequenciação e tempo de ionização por laser de dessorção de matriz da espectrometria de massa de voo. Todos os 17 isolados obtidos foram identificados como Lactobacillus plantarum, excepto um identificado como Pediococcus acidilactici. Quatro isolados iden- tificados como L. plantarum (números de adesão KJ026587.1, KM207826.1, KC83663.1 e KJ958428.1) por pelo menos duas das técnicas utilizadas e isolar 17 de forma diferente identificadas por todos os métodos utilizados foram seleccionadas como representantes e depois rastreadas para propriedades probióticas. Estes isolados apresentam atributos probióticos fenotípicos incluindo tolerância a sais ácidos e biliares, capacidade de aderir aos intestinos e posse de actividades antagónicas contra Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli. As bactérias lácticas isoladas do leite de cabra Saanen mostraram poten- tial para serem utilizadas como probióticas sustentáveis na indústria caprina. A utilização bem sucedida de probióticos em animais depende da disponibilidade de isolados apropriados provenientes da espécie animal hospedeiro de gelo. Este estudo é uma contribuição positiva para a identificação de isolados com potencial para formulação como microbianos alimentados directamente para cabras Saanen sul-africanas. Palavras-chave Bactérias de ácido láctico . Probióticos . Lactobacillus . Microbianos de alimentação directa . Cabras Saanen Introdução Durante anos, os antibióticos foram incluídos na alimentação animal a níveis sub-terapêuticos, actuando como promotores de crescimento e para tratar ou prevenir doenças [27]. No entanto, com o aumento dos con- ceros públicos sobre o desenvolvimento de resistência antimicrobiana e transferência de genes de resistência aos antibióticos, os antibióticos têm sido proibidos em algumas áreas do mundo. Assim, a necessidade de encontrar métodos alternativos para controlar e prevenir a colonização de bactéis patogénicos tem aumentado. Na nutrição animal, os probióticos dos três grupos diferentes, bactérias lácticas [40], esporos de Bacillus [1], ou leveduras [36] são utilizados como aditivos alimentares. A modulação da microbiota intestinal com novos aditivos alimentares, tais como probióticos, é uma questão actual na criação animal e cria possibilidades fascinantes [16]. O grupo de trabalho conjunto da Organização das Nações Unidas para a Alimentação e Agricultura (FAO) e da Organização Mundial de Saúde (OMS), definiu os probióticos como microorganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem um benefício de saúde ao hospedeiro^ [21]. Os probióticos mais estudados são as bactérias lácticas (LAB), particularmente Lactobacillus e Bifidobacterium. A definição de probiótico requer que a eficácia e segurança de todas as estirpes seja verificada e, portanto, a avaliação desta constitui uma parte importante da terização-caracteriana. Como as capacidades probióticas são dependentes da estirpe, os métodos para uma identificação fiável do LAB são de grande importância. A identificação do LAB com base em padrões de fer- mentação de hidratos de carbono não é fiável e não é suficientemente precisa para distinguir as estirpes estreitamente relacionadas devido aos seus requisitos nutricionais semelhantes [34]. Nos últimos anos, a identificação fenotípica é complementada por técnicas moleculares como a análise sequencial do rDNA parcial de 16S e MALDI- TOF. A selecção de bactérias probióticas promissoras deve cumprir os padrões de cer- tain, e os testes in vitro são realizados quando se efectua o rastreio dos candidatos probióticos. Estas estirpes devem ser geralmente reconhecidas como seguras com possibilidades mínimas para a transferência da resistência aos antibióticos [45]. As estirpes probióticas devem ter a capacidade de sobreviver através do tracto gastrointestinal (GIT), particularmente pH baixo e elevada toxicidade biliar prevalecente no tracto digestivo superior. Além disso, as estirpes bacterianas devem ter a capacidade de aderir à epinefrina intestinal-télio e produzir actividades antimicrobianas em direcção a microrganismos potencialmente patogénicos [43]. O objectivo do estudo do cur- rent foi identificar bactérias lácticas isoladas do leite de cabra cru e rastreá-las para atributos probióticos, a fim de seleccionar estirpes que podem ser utilizadas na indústria caprina como microbianos alimentados directamente. Materiais e Métodos Recolha de amostras de leite Um total de 40 amostras de leite de cabra cru foram recolhidas na Divisão de Pequenos Animais do Conselho de Investigação Agrícola - Instituto de Produção Animal, Irene, África do Sul. As amostras de leite foram obtidas em condições higiénicas de animais saudáveis, através da ordenha manual. Alíquotas de 200 ml de sam- ple por cabra foram recolhidas em garrafas Schott estéreis e depois transportadas em gelo para o laboratório para análises com - em 2 h. Contagens de Bactérias Viáveis Totais (TVBC) e Contagens de Coliformes Cada amostra de leite foi vortexada para assegurar a homogeneização. Depois 1 ml de cada amostra foi pipetada assepticamente em 9 ml (diluição 1:10) de solução salina estéril (0,85% p/v NaCl) num tubo de ensaio. A mistura foi então vortexada (Heidolph REAX 2000, Alemanha) durante 5 minutos. Posteriormente, a suspensão foi diluída em série até 10-6 diluição utilizando solução salina estéril. Em seguida, 1 ml de amostra de cada diluição foi laminada em ágar nutriente (Biolab) e ágar biliar vermelho-violeta (Biolab) em trip- licates para contagem total e coliformes, respectivamente. As placas foram incubadas a 37 °C durante 48 h. O total de unidades formadoras de colónias por mililitro (cfu ml-1 ) de bactérias aeróbias e coliformes foram registadas. Isolamento e identificação de bactérias ácidas lácticas Um mililitro de cada amostra de leite foi adicionado assepticamente a 9 ml de solução salina estéril 0,85% e misturado cuidadosamente. Foram realizadas diluições em série e foram plaqueadas alíquotas de 1 ml das diluições em ágar De Man, Rogosa e Sharpe (MRS) suplementadas com 0,05 g l-1 cysteine-HCL (MRS-cysHCL) em triplicado pelo método da placa de verter [2]. A identificação dos isolados a nível do género foi efectuada segundo os critérios de Sharpe [38], utilizando métodos morfológicos, fenotípicos e bioquímicos. Os isolados foram ex aminados microscopicamente para reacção grama e catalase pro- duction [19]. Além disso, todos os isolados foram testados para a pro-dução de CO2 da glucose em tubos de caldo MRS e para a sua capacidade de crescimento a 10 e 45 °C [29]. A capacidade dos isolados para fermentar carboidratos foi estudada utilizando o sistema API 50CH (Biomérieux, França), de acordo com as estruturas em que o fabricante se encontrava. Para a caracterização genotípica, o ADN genómico total dos isolados foi extraído utilizando o MasterPure DNA Purification Kit (Epicentre, Madison, WI, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, com pequenas modificações. A reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada utilizando o Taq PCR Kit (BioLabs, New England), de acordo com as especificações do fabricante. A amplificação do 16 rDNA foi realizada utilizando ambos os primários 27F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′) e 1525R (5′-AGG GAG GTG WTC CAR CCG CA-3′ [26]. Para análise da sequência do 16S rDNA, os produtos PCR foram purificados com DNA Clean e Concentrator™ -25 (Zymo Research), de acordo com as instruções do fabricante, e depois sequenciados com o iniciador 27F. A sequenciação dos amplicons foi realizada utilizando o Big-Dye Sequencer ABIPRISM 313 × l. As homologias de sequências foram examinadas comparando as sequências obtidas com as da base de dados GenBank utilizando o software BLAST e identificadas de acordo com o parente mais próximo. Os isolados também foram iden- tificados utilizando análise MALDI-TOF numa MALDI BIOTYPER MICROFLEX LT (Bruker Daltonik, Bremen, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Rastreio de Isolados para Atributos Probióticos A tolerância ácida dos isolados foi estudada utilizando um método descrito por Liu et al. [24] com pequenas modificações. Em resumo, uma alíquota de 1 ml das culturas nocturnas (ajustada a aproximadamente 1 × 108 cfu ml-1 ) foi inoculada em 100 ml de caldo MRS-cysHCL e ajustada a pH 1,0, 2,0 e 3,0 utilizando ácido clorídrico 1 N (HCL). As culturas foram então incubadas anaerobiamente a 37 °C em frascos anaeróbicos (Oxoid) contendo AnaeroGen™ saqueta de 2,5 L (Thermo Scientific). Em seguida, o crescimento do bacte- rial foi examinado a 0, 1, 2 e 3 h de incubação utilizando a técnica da placa de verter. Tolerância biliar A capacidade dos isolados de crescer na presença de sal biliar foi determinada no caldo MRS-cysHCL, como descrito por Walker e Gilliland [46]. Em resumo, os caldos de MRS-cysHCL foram enriquecidos com 0,3 e 0,5% de boi-cavala (Biolab), e em seguida ocluídos com 1 × 108 cfu ml-1 de cada cultura. As culturas foram incubadas anaerobiamente a 37 °C em frascos anaeróbios com con- tintura AnaeroGen™ saqueta de 2,5 L (Thermo Scientific). A sobrevivência e crescimento das culturas foram examinados a 0, 2, 4 e 24 h de incubação utilizando a técnica de placa pour pour. Teste de Susceptibilidade Antibiótica A susceptibilidade antibiótica dos isolados foi avaliada utilizando o método de difusão em disco de acordo com Charteris et al. [8]. As culturas de caldos de isolados foram preparadas em MRS-cysHCL e ajustadas a 0,5 padrões McFarland (equivalente a 1 × 108 cfu ml-1 ). Depois, 100 μl alíquotas de culturas bacterianas recentemente preparadas foram cada uma espalhadas em placas de ágar MRS. Os discos antibióticos foram colocados na superfície do ágar e as placas foram incubadas anaerobiamente a 37 °C durante 24 h em frascos aeróbios (Oxoid) contendo AnaeroGen™ sachês de 2,5 L. O padrão de susceptibilidade foi avaliado para vancomicina (30 μg), ampicilina (10 μg), cefalotina (30 μg), co-trimoxazol (25 μg), ácido nalidíxico (30 μg), gentamicina (10 μg), penicilina G (10 μg), tetraciclina (30 μg), eritromicina (15 μg) e oxitetraciclina (30 μg). Os diâmetros das zonas de inibição foram medidos desde a borda até à borda da zona utilizando uma régua e os resultados foram registados como média de três leituras. Produção de actividades antimicrobianas Os isolados LAB foram testados para a produção de actividades antimicrobianas contra Escherichia coli (ATCC 35218), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Proteus vulgaris (ATCC 6380), Salmonella typhimurium (ATCC 49416), e Staphylococcus aureus (ATCC 33591) usando a técnica de ágar bem diffu- sion de acordo com Mohankuman e Murugalatha [28]. Os isolados foram cultivados separadamente em caldo MRS-cysHCL durante 48 h a 37 °C. Os sobrenadantes sem células foram obtidos por centrifugação das culturas a 2236 x g durante 10 min à temperatura ambiente. Poços de 6 mm de diâmetro foram feitos nas placas de ágar Mueller Hinton (Oxoid) so- lidificado espalhadas uniformemente sep-rateadamente com culturas nocturnas de cada agente patogénico de teste. Alíquotas do sobrenadante de cultura LAB (100 μl) foram distribuídas nos poços, e as placas foram incubadas durante a noite a 37 °C. Os diâmetros das zonas claras de inibição do crescimento à volta de cada poço foram medidos desde a borda até à borda da zona, utilizando uma régua. Ensaio de aderência O íleo suíno, recolhido dos porcos imediatamente após o abate - ter, foi dissecado assepticamente em secções de 3 cm de comprimento e mantido em gelo durante um máximo de 9 h. Os 5 isolados bacterianos foram cada um inoculado em 250 ml de caldo MRS-cysHCL e incubado - ed a 37 °C a OD600 = 1,2, o que equivale a aproximadamente 1 × 108 cfu ml-1 . Uma secção de íleo foi adicionada a cada uma das culturas e incubada durante 6 h a 8 °C num agitador rotativo. As subamostras das culturas foram retiradas a cada 2 h, diluídas em série e laminadas em placas de ágar MRS-cysHCL. As colónias foram contadas após 24 h de incubação a 37 °C. Além disso, as secções do íleo foram retiradas assepticamente dos frascos e da camada de muco cuidadosamente raspadas com uma lâmina de vidro estéril. As preparações das amostras de muco em lâminas microscópicas foram tratadas com a sonda de viabilidade BacLight (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, EUA) para visualização de bac- ter aderido. As lâminas foram incubadas durante 10 min no escuro à temperatura ambiente. Imagens de células bacterianas aderentes foram capturadas utilizando uma câmara CCD de alto desempenho, montada num microscópio de epi-fluorescência Nikon Eclipse E400, equipado com uma objectiva de óleo Dic H × 60/1.4 e filtros. Secções de íleo suspensas em caldo MRS-cysHCL mas não inoculadas com qualquer bactéria serviram de controlo [6]. Resultados Contagem de bactérias totais viáveis (TVBC) e Contagem de coliformes A contagem média de bactérias totais viáveis (TVBC) obtida do leite cru de cabras foi de 2,33 × 102 cfu ml-1 . Esta contagem estava dentro dos padrões aceitáveis estabelecidos no regulamento R.489, que estabeleceu os padrões legais mínimos para o leite cru de 99%), enquanto que para L. rhamnosus e um L. plantarum, foi obtida uma identificação duvidosa. Em seguida, os 17 isolados foram ainda submetidos a 16S rDNA sequenciados para identificação. Com base na sequência parcial de 16S rDNA, verificou-se que o bacalhau dominante encontrado no leite cru de cabra era lactobacilos. Dez isolados, incluindo o isolado que foi identificado como L. rhamnosus utilizando o sistema API, foram identificados como Lactobacillus pentosus e sete como Lactobacillus plantarum. Numa tentativa de discrimi- nate entre estas bactérias, identificámos ainda mais os isolados utilizando os seus perfis proteicos utilizando a análise MALDI-TOF. Os resultados da análise de MALDI-TOF permitiram a identificação fiável dos 5 isolados, com resultados de registo de biótipos >2.300, o que é considerado como uma identificação de espécies altamente provável. Para os 11 isolados, a análise MALDI-TOF produziu pontuações de ≥2.000, indicando uma identificação segura do género ou de espécies prováveis. O restante isolado foi provavelmente identificado ao nível do género com pontuação >1.700. Dos 17 isolados obtidos a partir de leite cru de cabra, foram seleccionados 5 representantes para o rastreio in vitro de atributos probióticos. Triagem de isolados para propriedades probióticas Tolerância ao ácido O tempo médio residente dos alimentos no estômago é de 3 h, e por conseguinte, os ensaios são normalmente executados durante esse tempo [30]. O efeito das condições ácidas de pH 2,0 e 3,0 sobre a viabilidade dos isolados LAB é mostrado na Fig. 1. Neste estudo, todas as estirpes de Lactobacillus plantarum e Pediococcus acidilactici isoladas do leite de cabra não mostraram tolerância ao pH 1,0, sem crescimento observado após apenas 1 h de incubação (dados não mostrados). Houve um declínio de células viáveis dentro de uma hora após a incubação para todos os isolados a pH 2,0, com uma diminuição muito maior para P. acidilactici (Fig. 1a). Não foi observado crescimento (registado como 1,25 cfu ml-1 na escala logarítmica) para todos os isolados após 2 h de incubação a este pH (Fig. 1a). Todas as estirpes de L. plantarum e isolados de P. acidilactici mostraram alguma resistência durante a sua exposição a pH 3,0. Para todas as estirpes de L. plantarum, houve um declínio de duas unidades de toros em contagens viáveis após 1 h. As contagens de viabilidade de P. acidilactici mostraram um declínio de dois toros após 2 h. As contagens residuais viáveis para todos os isolados foram superiores a 106 cfu ml-1 após 3 h a pH 3,0. Além disso, os resultados indicam que o isolado identificado como P. acidilactici era mais tolerante a ácido do que todos os isolados de L. plantarum. Tolerância Bile Bactérias a serem utilizadas como probióticos devem ser capazes de resistir a factores hibitórios no tracto gastrointestinal, tais como sais biliares. A capacidade de todos os isolados de resistir aos sais biliares foi revelada após 24 h de incubação a 37 °C (Fig. 2). Houve um vinco na contagem viável de todos os isolados durante quatro horas de incubação na presença de 0,3 e 0,5% de ox-gall. Isto foi seguido por uma diminuição na contagem de células viáveis após 24 h em 0,3% de concentração de gordura de boi (Fig. 2a). Contudo, as contagens viáveis para as células incubadas em 0,5% de ox-gall permaneceram as mesmas, mesmo após 24 h de exposição (Fig. 2b). Susceptibilidade aos antibióticos Um requisito fundamental para as estirpes probióticas é que não devem transportar genes de resistência aos antibióticos transferíveis [3]. Neste estudo, todos os 5 isolados do leite de cabra cru foram testados quanto à sua susceptibilidade a dez antibióticos, utilizando o método de difusão em disco. Todos os isolados mostraram resistência à gentamicina, ácido nalidíxico e vancomicina entre todos os antibióticos testados (Tabela 2). Ensaio de Actividade Antimicrobiana O diâmetro das zonas de inibição mostrou que todos os isolados têm efeitos antibacterianos contra os patogéneos testados (Tabela 3). A propriedade inibitória observada dos isolados podia ser atribuída à produção de ácidos orgânicos, uma vez que foi perdida após a neutralização dos sobrenadantes da cultura com hidróxido de sódio. Todos os isolados mostraram efeitos antibacterianos contra os agentes patogénicos testados, sendo todos eles mais antagónicos contra P. aeruginosa e S. typhimurium (Quadro 3). Houve ausência de actividade antimicrobiana em sobrenadantes neu- tralizados (pH 7,0) livres de células de todos os isolados. Ensaio de adesão A adesão das células lactobacilares ao muco intestinal foi utilizada para avaliar a capacidade das estirpes para colonizar os intestinos. A coloração com a sonda de viabilidade BacLight revelou forte aderência dos isolados ao muco ileum. Com base nos dados de contagens viáveis obtidos (Tabela 4), a maioria dos isolados aderiu ao muco do íleo durante a incubação de 6 horas. As contagens negativas obtidas na incubação de 2 e 4 h poderiam ser uma indicação de sub-contagem de células bacterianas causadas por cadeias e tufos formados durante o crescimento. A coloração do muco com a sonda de viabilidade BacLight indicava que a maioria das células aderidas continuava a ser viável. Discussão Um dos requisitos na produção de leite cru de alta qualidade é a manutenção de contagens bacterianas aceitáveis que satisfaçam os padrões oficiais de qualidade do leite. A avaliação dos resultados foi realizada em conformidade com as normas estabelecidas no parágrafo 7 do Anexo A nos regulamentos R.489 de 2001 que estabelecem que a contagem total de bactérias não pode exceder 5 × 104 ufc ml-1 (leite cru destinado ao consumo) e 2 × 105 ufc ml-1 (leite cru destinado a processamento posterior). A presença de coliformes no leite e nos produtos lácteos é uma indicação de pró-leite não higiénico e/ou manipulação inadequada de qualquer um dos utensílios de leite [15]. A legislação mencionada refere ainda que, tanto para a puri- pação do consumo directo como para o processamento posterior, os coliformes devem ser inferiores a 20 utensílios de utensílios de leite [15]. Além disso, não se espera Escherichia coli em 1 ml de leite destinado ao consumo directo, bem como não devem estar presentes colónias em 0,01 ml de leite destinado a processamento posterior [39]. O kit API 50CH identificou 16 isolados como L. plantarum e 1 como L. rhamnosus. Vale a pena mencionar que o isolado identificado como L. rhamnosus, que indica ser em forma de vara, apareceu como células de forma redonda que formavam clusters sob o microscópio. Isto sugeriu que o API 50CH identificou erroneamente este isolado. Com base na sequência parcial de 16S rDNA, dez isolados foram identificados como Lactobacillus pentosus e sete como Lactobacillus plantarum. Contudo, apesar do facto de 16S rDNA sequenciação ser considerada como o "padrão ouro" para a identificação de bactérias anaeróbias, não pode discriminar L. plantarum e L. pentosus devido ao elevado valor de identidade (99%) partilhado pelas duas espécies. Marroki et al. [26] relataram uma descoberta semelhante, afirmando que L. plantarum e L. pentosus têm sequências de rDNA muito semelhantes. identificação cor-ret dos 17 isolados estava dependente da presença das estirpes de referência na base de dados MALDI-bioTyper 3.0 porque a espécie da estirpe de referência dará a correspondência mais próxima para a identificação das estirpes testadas. Dos 17 isolados, 15 (88%) foram identificados com precisão a nível de espécie como Lactobacillus plantarum com pontuações de ≥2.000, e os restantes 2 (11,76%) como Pediococcus acidilactici com pontuações entre 1.700 e 2.000. Um dos isolados identificados como P. acidilactici foi isolado 17, que foi identificado como Lactobacillus usando sequenciação API e rDNA. Uma vez que este isolado foi observado em forma de cocci, a identificação produzida por MALDI TOF foi escolhida para este isolado. Apesar das discrepâncias observadas, todas as técnicas utilizadas indicaram que L. plantarum era o LAB dominante no leite de cabra. Os resultados deste estudo diferiram dos de outros investigadores, uma vez que a maior parte dos lactococos foi o LAB dominante no leite de cabra [4, 31, 41]. As disparidades no LAB dominante poderiam ser atribuídas às diferentes raças de caprinos, uma vez que nenhum dos estudos anteriores isolou o LAB do leite de cabras Saanen da África do Sul. A raça tem um efeito significativo na composição do leite, o que tem impacto na microbiota aí presente [4]. No entanto, os resultados estavam em correlação com os de [12, 32], indicando a presença de números elevados de L. planturum no leite de cabras. A presença de P. acidilactici no leite de cabra também foi recentemente notificada [32]. A fim de exercer os seus efeitos benéficos no hospedeiro, os probióticos devem permanecer vivos tanto durante a sua ingestão como durante o seu trânsito, antes de atingirem o intestino grosso. Têm de passar pelas condições stressantes do estômago com pH entre 1,5 e 3,0, e no intestino superior que contém bílis [10, 23]. Neste estudo, todos os isolados não mostraram tolerância ao pH 1,0, com uma diminuição de células viáveis em pH 2,0 dentro de uma hora após a incubação. Este fenómeno foi observado para um número de bactérias probióticas onde se observou frequentemente uma diminuição substancial na viabilidade das estirpes a pH 2,0 ou inferior [17]. Contudo, as contagens residuais viáveis para todos os isolados foram superiores a 106 cfu ml-1 após 3 h a pH 3,0. Os resultados observados no estudo actual correlacionam-se com relatórios de [9], afirmando que os lactobacilos entéricos são capazes de tolerar o pH 3,0 durante algumas horas e o pH 2,0 durante vários minutos, enquanto são destruídos a pH 1,0. A tolerância biliar tem sido descrita como um factor importante para além da tolerância de pH para a sobrevivência e crescimento de probióticos no tracto gastrointestinal. Embora a concentração da bílis no tracto gastrointestinal varie, acredita-se que a concentração média da bílis intestinal seja de 0,3%, e sugere-se que o tempo de permanência seja de 4 h [14, 33]. A resistência dos isolados a ox-gall pode muito provavelmente ser atribuída à expressão das proteínas relacionadas com a resistência da bílis por parte das células bacterianas [18]. Devido à alta tolerância do ox-gall por todos os isolados, espera-se que as estirpes sejam provavelmente eficazes na desconjugação do sal da bílis. A esmagadora propagação da resistência aos antibióticos nas comunidades microbianas levou a preocupações sobre a sua possível exis- tência, mesmo em espécies bacterianas benéficas, o que inclui probióticos [37]. A importância de avaliar o padrão do perfil de resistência aos antibióticos dos isolados é restringir o uso de culturas probióticas que albergam genes de resistência aos antibióticos transferíveis. Os isolados apresentam resistência à gentamicina, ao ácido nalidíxico e à vancomicina. A resistência dos lactobacilos a estes antibióticos tem sido relatada por investigadores noutros locais. D'Aimmo et al. [11] reportaram resis- tância de L. acidophilus e L. casei ao ácido nalidíxico enquanto Liu et al. [25] reportaram resistência dos isolados de Lactobacillus à gentamicina e a de várias espécies de Lactobacillus à vancomicina, ao L. rhamnosus e L. casei. No entanto, esta resistência pode não colocar problemas, uma vez que os seus genes demonstraram não ser transferíveis. Saarela et al. [35] relataram que os lactobacilos apresentam naturalmente uma vasta gama de resistência aos antibióticos, mas na maioria dos casos esta resistência não é do tipo transferível e, portanto, não costuma criar uma preocupação de segurança. Preocupações recentes sobre o uso desenfreado e indiscriminado de antibióticos para o tratamento de doenças e promoção do crescimento do stock vivo, levaram a um interesse crescente na aplicação de probióticos e dos seus metabolitos antimicrobianos como estratégias antimicrobianas alternativas para o tratamento e prevenção de infecções [20]. As bactérias mais comuns que causam mastite nas cabras são Staphylococcus aureus, seguidas de ocorrências menores - rência das causadas por Escherichia coli, Clostridium perfringes, Streptococcus, Pseudomonas e Nocardia gen- era [5]. A diarreia infecciosa dos animais neonatais é uma das condições mais comuns e economicamente devastadoras na indústria da agricultura animal. Entre as causas bacterianas de enterite em animais de alimentação neonatal, as Escherichia coli, e Salmonella spp. são as mais comuns e economicamente portadoras, mas o Clostridium perfrigens também foi identificado como causa de doença entérica e diarreia [22]. Em ambos os casos, para prevenir o aparecimento da doença, foram adicionados antibióticos à matéria-prima. Contudo, o uso de antibióticos na alimentação animal foi regulamentado e foram recomendados métodos orgânicos para o gado devido a problemas como o advento de bactérias resistentes e resíduos de antibióticos nos produtos animais [27]. Assim, a actividade antimicrobiana contra os agentes patogénicos que devastam a produção caprina é uma propriedade desejável dos probióticos a serem utilizados como culturas microbianas alimentadas directamente na criação de caprinos. O diâmetro das zonas de inibição mostrou que todos os isolados têm efeitos antibacterianos contra os agentes patogénicos testados (Quadro 3). Assim, os isolados LAB do leite cru de cabras são potenciais candidatos a serem utilizados no controlo dos agentes patogénicos responsáveis pela mastite e enterite bacteriana em caprinos. A capacidade dos probióticos de aderir ao sítio alvo para colonização é uma característica importante e vital para a sua expressão de óptima funcionalidade. Devem aderir às células epiteliais da mucosa que revestem o intestino para serem designadas como probióticas [7, 44], o que também depende do número de bactérias adicionadas. O nível de adesão das bactérias correlaciona-se positivamente com o número de bactérias adicionadas em determinado ponto, quando a saturação dos sítios de ligação po-tencial nas linhas celulares provavelmente ocorre [13]. Com base no número de células viáveis registadas no final de 6 h de incubação com íleo suíno, todos os isolados aderiram simila-larly ao muco. Tuomola e Salminen [42] também reportaram resultados semelhantes em que a diferença na adesão de isolados probióticos foi pequena utilizando a sonda de viabilidade LIVE/DEAD BacLight para estudar a adesão de 12 estirpes diferentes de Lactobacillus. Uma vez que os estudos de aderência foram realizados utilizando por- cine ileum, futuros estudos podem investigar esta propriedade utilizando especificamente intestinos de cabras. No entanto, os dados reportados demonstram a capacidade dos isolados de aderir ao muco e, portanto, o seu potencial para colonizar com sucesso as células intestinais. Embora este estudo tenha sido realizado in vitro, o L. plantarum e o P. acidilactici isolados cumpriram a maioria dos critérios utilizados para os probióticos. Mostraram a capacidade de tolerar, sobreviver às estressantes condições gastrointestinais e a capacidade de produzir actividades antimicrobianas contra alguns agentes patogénicos causadores de doenças "com- mon" na indústria caprina. Conclusão A combinação de métodos aplicados para a identificação de isolados mostrou que Lactobacillus plantarum era a espécie dom- inant no leite de cabras Saanen da África do Sul e Pediococcus acidilactici em menor escala. Embora este estudo tenha sido realizado in vitro, o L. plantarum e o P. acidilactici isolados cumpriam a maioria dos critérios utilizados para os probióticos. Mostraram resistência ao baixo pH e tolerância à bílis, podendo assim sobreviver às estressantes condições gastrointestinais. Também demonstraram a capacidade de aderir ao mu- cus intestinal; bem como a capacidade de produzir actividades antimicrobianas contra alguns agentes patogénicos causadores de doenças comuns na indústria caprina.

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