A Desreplicação Na Química

Desreplicação

Derivado do inglês DEREPLICATION é um termo utilizado pelos químicos de produtos naturais para os processos de identificação rápida de substâncias conhecidas, foi inicialmente introduzido na literatura cientifico-acadêmico no inicio dos anos 90, sendo definido como uma etapa crucial no processo de triagem de extratos brutos, objetivando estabelecer o grau de ineditismo de substâncias presentes nesses extratos, de maneira a se evitar o re-isolamento e determinação estrutural de uma substância que não seja inédita.  Esse processo foi inicialmente utilizado para a busca de substâncias especificas em meios de crescimento de diferentes linhagens de microrganismos, tais como a TELEOCIDINA (1), a ELAIOFILINA (2), e a GELDANAMICINA (3).

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Simultaneamente, o termo “dereplication” foi utilizado pela primeira vez em processo de triagem (screening) de extratos com atividade antiviral (anti-HIV) realizado por pesquisadores do National Cancer Institute (NCI).  A partir de então, este termo foi amplamente aceito e utilizado, tanto por pesquisadores da área acadêmica como da iniciativa privada, principalmente no que se refere à indústria farmacêutica.

Já em 1996, pesquisadores da Hoescht e da Lepettit utilizaram técnicas acopladas HPLC/MS (ESI) para analisar a presença de antibióticos teicoplanina, fenelfamicinas e verrucarinas. Zhou e Hamburger desenvolveram um método de desreplicação para a análise simultânea de diversos produtos naturais, utilizando ionização por eletrospray (ESI), no caso de substâncias polares, e ionização química à pressão atmosférica para análise de substâncias moderadamente polares, demonstrando ser de ampla aplicação. Depois disso vários outros sistemas de desreplicação foram desenvolvidos.

As técnicas de desreplicação incluem a utilização rotineira de técnicas cromatográficas hifenadas, as quais são poderosas ferramentas para a análise preliminar de extratos brutos, dentre estas, aquelas que utilizam cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas que são as mais comumente utilizadas. Isso porque requerem equipamentos de menos custo quando comparado com aquelas que utilizam ressonância magnética nuclear, além de necessitarem uma menor quantidade de amostra para análise e necessitarem de menor tempo de análise também.

Essa técnica está continuamente em desenvolvimento no âmbito da pesquisa em produtos naturais, devido â sua versatilidade, rapidez, confiabilidade e reprodutibilidade na análise de extratos brutos, de maneira a prover uma rápida priorização de extratos e substancias a serem isoladas, evitando-se o re-isolamento de substâncias já conhecidas.

Isso porque quando uma substância é isolada de um extrato, identificada por diversas técnicas analíticas e reportada para a comunidade cientifica, torna-se possível utilizar os dados relatados para a identificação dessa mesma estrutura em outros extratos, sem a repetição de um novo processo de isolamento e identificação, acarretando numa diminuição significativa de tempo e material necessário para a analise do novo extrato, trazendo benefícios para a natureza, economia e avanços mais rápidos para a ciência. Além disso, algumas perguntas podem ser respondidas apenas com a identificação de quais substâncias, ou classe de substâncias, sejam elas inéditas ou não, estão presentes no extrato, sem a necessidade de isolamento especificamente. Desta forma, a desreplicação torna a análise química de um extrato mais eficiente, confiável, além de direcionar o estudo para o descobrimento de substâncias inéditas e, possivelmente, com atividade biológica associada.

Atualmente se considera que a desreplicação constitui uma etapa absolutamente essencial na descoberta de produtos naturais bioativos estruturalmente inéditos, tanto que já existe uma patente sobre o método de desreplicação de produtos naturais. Sendo assim, esse processo de desreplicação na pesquisa e descoberta de produtos naturais deve ser cada vez mais utilizado e aprimorado.

A utilização de análise por HPLC-UV-MS de extratos brutos e/ou frações enriquecidas para a sua desreplicação permite a análise simultânea de substâncias majoritárias presentes nos extratos brutos e frações cramatográficas, segundo o perfil de sua absorção no ultravioleta-visível (UV) e seu espectro de massas. Além de ser uma técnica muito sensível, a análise é rápida e realizada de maneira simultânea para todas as substâncias presentes em extratos ou frações enriquecidas. O procedimento consiste em analisar misturas (extratos brutos e frações enriquecidas) pela aplicação de um gradiente de eluição em colunas de fase reversa, com o fim de detectar substâncias muito polares (alguns aminoácidos, peptídeos hidrossolúveis, açúcares), polares (outros aminoácidos, nucleosídeos e bases nucléicas), medianamente polares (alguns alcaloides, derivados glicosilados, substâncias polihidroxiladas, outros peptídeos) e apolares (alcaloides lipofílicos, derivados de terpenos, peptídeos lipofílicos, derivados aromáticos, lactanas macrocíclicas, etc.). Desta forma é obtido um perfil químico dos extratos bioativos em função das absorções no UV e espectros de massas de seus constituites. Finalmente, são selecionados quais dos extratos deverão ser estudados com base na informação em bancos de dados (SciFinder, Dictionary of Natural Products e MarinLit), que contém informações sobre a massa molecular de compostos, bem como sua absorção no UV.

Considerações técnicas

Como desreplicação se refere à identificação rápida de metabolitos secundários conhecidos, é óbvio que métodos analíticos confiáveis, robustos, rápidos e sensíveis são necessários para executar uma desreplicação eficiente procedimento. Com os notáveis desenvolvimentos de ciências da separação, técnicas espectroscópicas e tecnologias analíticas de alto rendimento, valiosas existem agora recursos para caracterizar estruturalmente produtos, não apenas como compostos puros, mas também dentro misturas complexas como extratos brutos de plantas ou meios de cultura microbiana.

Sistemas cromatográficos analíticos e possibilidades de hifenização

Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) continua sendo de longe a técnica mais usada para separar os compostos naturais na escala analítica. A HPLC é robusta, fácil de usar e aplicável a uma ampla diversidade de compostos, mesmo a partir de materiais de composição química complexa. Mais recentemente, cromatografia líquida de alta pressão (UHPLC) permitiu uma redução notável dos tempos de separação enquanto melhora a sensibilidade, resolução e reprodutibilidade em comparação com HPLC convencional. Ambas as técnicas, atualmente são aplicados à análise de produtos naturais para diversas finalidades, incluindo controle de qualidade, caracterização de extratos brutos de plantas ou alta impressão digital de rendimento (Wolfender et al. 2010a, b; Eugster et al. 2011). Cromatografia em camada fina (TLC ou HPTLC) é outra técnica cromatográfica frequentemente utilizado para a análise preliminar de extratos ou para a identificação rápida de compostos dentro de misturas simplificadas obtidas após pré-fracionamento de uma amostra natural bruta (Hook et al. 1997; Hook 1998; Tan et al. 2011).

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