DIGESTÃO ENZIMÁTICA DE DNA

1 INTRODUÇÃO

As enzimas de restrição, ou também denominadas de endonucleases de restrição, são as ferramentas básicas da engenharia genética, desempenhando função de clivagem (corte) da molécula de DNA em pontos específicos, em reconhecimento a determinadas sequências de nucleotídeos. (ALBERTS, 2009)

Hoje em dia, a biologia molecular utiliza centenas de endonucleases capazes de seccionar o duplo filamento polinucleotídico da molécula de DNA em lugares determinados. Dessa forma, submetidos à técnica de eletroforese, os pedaços seccionados pelas enzimas passam por análise comparativa de bandas transversais reveladas em um filme, permitindo, por exemplo, a identificação de pessoas: possíveis suspeitos de um crime ou na determinação da paternidade, tendo no laudo legitimidade relativa de competência jurisdicional. (ALBERTS, 2009)

As enzimas podem ser divididas em quatro tipos, no entanto, as de tipo 2 metilam e clivam o mesmo sítio de reconhecimento, sendo assim a mais utilizada pela biologia molecular. Elas se ligam ao DNA como monômeros, mas o clivam de modo cooperativo, através da dimerização com uma subunidade contendo um domínio de clivagem. (ALBERTS, 2009)

Outra propriedade importante de algumas enzimas de restrição são as "pontas adesivas" ou coesivas. As pontas são chamadas de adesivas porque, sendo uni filamentares, elas podem se parear com uma sequência complementar. Às vezes, os cortes são na mesma posição em cada um dos dois filamentos de polaridade inversa (clivagem simétrica). As enzimas de restrição mais úteis fazem cortes que são assimétricos, ou seja, em posições diferentes. (ALBERTS, 2009)

Um segmento palíndromo de DNA é aquele em que ambos os filamentos têm a mesma sequência de nucleotídeos, mas com polaridade inversa. Cada enzima de restrição reconhece uma sequência palíndrômica. (ALBERTS, 2009)

Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrição já foram identificadas. A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviação do nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gênero e as outras duas a espécie, seguido de uma letra, que indica a estirpe e/ou um algarismo romano, que indica a ordem da descoberta. Por exemplo, a enzima de restrição denominada de EcoRI é purificada de uma Escherichia coli, estirpeRY13, e foi a primeira a ser descoberta. (ALBERTS, 2009)

2 OBJETIVO

Realizar a digestão enzimática simples e dupla, e montar um mapa de restrição de um DNA plasmidial a partir dos dados obtidos após eletroforese em gel de agarose.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 MATERIAIS

3.1.1 REAGENTES E SOLUÇÕES

• Água Milli-Q®

• Corante

• DNA – plasmídeo

• Enzima Hind III

• Enzimas Bam HI

• Solução tampão

• Tampão de Hind III

3.1.2 EQUIPAMENTOS

• Banho de Gelo

• Banho Maria

• Béquer de 200 ml

• Cuba de eletroforese

• Fonte

• Micropipeta

• Placa de gel de agarose

• Tubo de 200 μl

3.2 MÉTODOS

Primeiramente, com o auxílio de uma micropipeta, pipetou-se 5 μl da amostra de DNA em um tubo de 200 μl, em seguida acrescentou 2 μl de tampão de enzima Hind III e 1 μl de enzima Hind III numa quantidade suficiente para 20 μl de Água-Milli®, homogeneizou-se levemente a amostra para realizar o processo de digestão simples.

Para a realização da digestão dupla, pipetou-se 5 μl da amostra de DNA em um tubo de 200 μl, em seguida acrescentou-se 2 μl de tampão de enzima Hind III e 1 μl de enzima Hind III e BamHI numa quantidade suficiente para 20 μl de Água-Milli® na sequência, homogeneizou-se a amostra.

Feito isso, coletou-se as duas amostras e encubou ambas em banho de gelo no béquer, tempo suficiente para o resfriamento das amostras, em seguida, colocou as amostras em banho maria durante 30 minutos numa temperatura de aproximadamente 37°C. Nesse tempo, preparou-se a cuba de eletroforese colocando a placa de gel de agarose e acrescentou-se a solução tampão até a placa de gel ficar submersa na cuba. Após o aquecimento, acrescentou-se em cada amostra 5 μl de corante 50% ao DNA digerido e homogeneizou-se levemente ambas, em seguida com o auxílio da pipeta aplicou-se uma parte da amostra de digestão simples na cavidade do gel