A Mobilidade de uma proteína em um campo elétrico

Sumário

Introdução Teórica ______________________________    páginas   2 e 3

Materiais ______________________________________    página 4

Procedimento ___________________________________   página 5 e 6

Resultados Encontrados ___________________________  página 7

Conclusão _______________________________________ página 8

Bibliografia  ______________________________________  página 9

Introdução Teórica

Quando uma solução é submetida a um campo elétron, os cátions migram para o catodo (polo negativo) e os ânions, (polo positivo). A técnica de eletroforese permite a separação analítica ou preparação dos componentes de uma mistura de varias espécies iônica com cargas diferentes. Além da separação qualitativa de partículas carregadas, a eletroforese permite separar partículas com a mesma carga, porém com quantidades de cargas diferentes. Tomando como exemplo as proteínas, que são polieletrólitos com cargas dependentes do PH do meio circundante, pode-se utilizar a técnica de eletroforese a fim de separar uma mistura dessas moléculas.

A mobilidade de uma proteína em um campo elétrico depende de alguns itens:

• Sinal de carga: orienta o sentido da migração ao polo do sinal oposto.
• Intensidade da carga: o deslocamento é proporcional à intensidade da carga.
• Grau de dissociação: a carga depende do PH do meio, que deve ser estabilizado pelo uso de tampões.
• Anfóteros.
• Força de campo elétrico.
• Distinção entre os eletrodos: o caminho percorrido é proporcional à força do campo que se mede pelo gradiente da voltagem (volts/cm).
• Tempo de corrida: o caminho percorrido é diretamente proporcional ao tempo de corrida.
• Tamanha forma de partícula.
• Viscosidade do meio.
• Concentração eletrolítica do meio: cada partícula com carga elétrica se circunda, por atração eletrostática, de íons de sinais contrários. Essa nuvem iônica tende a migrar em sentido contrato, reduzindo a velocidade da partícula central. A densidade da nuvem iônica depende da concentração iônica do eletrólito ___ força iônica do tampão.

O fato mais importante pelo qual a eletroforese se distingue de todas as outras técnicas de separação de misturas é que todas as partículas da mesma espécie que possuem a mesma carga e se repelem mutualmente, evitando conglomerações, formação de complexos e reação entre elas.

Cada partícula migra independente, mantendo sua estrutura e suas propriedades.

O que torna a eletroforese aplicável a todos os íons, desde os inorgânicos ate moléculas mais complexas (proteínas), incluindo também partículas macroscópicas portadoras de cargas elétricas, é o fato de suas características não sofrerem alterações.

No caso das proteínas, os radicas polares dos aminoácidos se comportam como ácidos ou bases fracas e podem sofrer ionização dependendo do PH. Por 0065emplo, uma proteína hipotética que tenha na sua superfície quatro grupos amina e quatro grupos carboxila; se todos se encontrarem iônicas, a proteína terá quatro cargas positivas e quatro cargas negativas; portanto, a resultante das cargas é igual à zero. Nessa situação a proteína não migra em um campo elétrico, e o PH é denominado ponto isoelétrico.

Alterando-se o PH da solução, é possível obter forma ionizada com resultante de cargas diferente de zero.

Quanto maior for o PH em relação ao ponto isoelétrico, maior será a resultante de cargas para o lado negativo, ate que todos os grupos tenham assumido o máximo ou o mínimo de ionização.

Proteínas do soro

A denominação das frações proteicas do soro pela eletroforese é conseguida graças à velocidade de migração diferente para cada uma das frações. No soro normal, foram identificadas as seguintes frações de proteínas que correspondem às frações de albumina e globulinas (α1, α2, β, ϒ).

Materiais e Reagentes

Materiais

• Cuba e fonte de eletroforese – consiste em uma cuba de material não-condutor de corrente elétrica e um retificador de corrente alternada em continua.
• Suportes – fitas de gel de agarose.
• Papel de filtro.
• Placas de Petri (cerca de 15 a 20 cm de diâmetro).
• Pinça.
• Estufa ou secador de cabelos.
• Cronômetro.

Reagentes

• Tampão Tris-HCI PH = 9,5.
• Corante negro amido – deixa as proteínas com a cor azul.
• Descorante – ácido acético a 5% (v/v) (utilizado para renovar o exceção de corantes das fitas de eletroforese).

Procedimento

O principio é o seguinte: em PH 9,5 os grupos ácidos das proteínas do sangue se dissociam formando ions de cargas negativas que podem ser separados por eletroforese. Vários componentes proteicos de uma mistura, como o soro, em PH acima e abaixo de seus pI, migram em velocidades variáveis em tal solução porque possuem diferentes cargas  elétricas na espécie de partícula. As proteínas tenderão a separar-se em camadas distintas.

1. Colocar 120 mL de um tampão na cuba – 60mL de cada lado
2. Separar o gel de Agarose da placa de acrílico
3. Aplicar o soro nas canaletas verticais em frente ao numero da placa do gel de agarose com microcapilar.
4. Colocar o gel de Agarose na cuba, voltado para baixo, coincidindo o lado ( + ) do gel com o ( + ) da cuba e o lado ( - ) do gel com o lado ( - ) da cuba.
5. Tampar a cuba, ligar, verificar se a formação de bolhas nos cantos ( indicam a passagem da corrente elétrica) e deixar por 30 minutos a 100 volts.
6. Desligar a cuba
7. Retirar o gel de agarose da cuba, eliminando o excesso  de tampão das bordas com o papel de filtro.
8. Mergulhar o gel voltado para cima em 200mL de corante ( negro de amido ) por  15 minutos  ( sem agitação ).
9. Retirar o gel de Agarose com uma pinça do corante e coloca-lo, sempre voltado para cima, em 200 mL de ácido acético a 5% ( descorante), com agitação por 30 segundos.
10.  Retirar o excesso de descorante do gel de agarose e colocar a 60°C ( foi usado secador de cabelo ), até que ele fique completamente seco.
11.  Colocar o gel de agarose em banhos sucessivos de descolorante ( ácido acético a 5% ), com agitação, até o fundo ficar transparente novamente.
12. Secar a 60°C ( Usar secador de cabelo )

Resultados

Nesse experimento obtivemos o resultado de um teste que já tinha sido realizado pois é um teste que demora muito tempo.

...